Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación
Summary
El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.
Abstract
Glucemia no controlada es una característica de la diabetes mellitus y promueve morbilidades como la neuropatía, nefropatía, y retinopatía. Con la creciente prevalencia de la diabetes, tanto inmune tipo 1 y relacionada con la obesidad de tipo 2, los estudios dirigidos a la delimitación de la fisiopatología de la diabetes y los mecanismos terapéuticos son de importancia crítica. Los β-células de los islotes pancreáticos de Langerhans son responsables de la secreción de insulina apropiadamente en respuesta a concentraciones elevadas de glucosa en sangre. Además de la glucosa y otros nutrientes, las células β también son estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que se secretan en el intestino en respuesta a una comida y actúan sobre los receptores de células β que aumentan la producción de monofosfato de adenosina cíclico intracelular ( AMPc). Disminución de la función de las células β, la masa y la capacidad de respuesta de la incretina son bien entendidos para contribuir a la fisiopatología de la diabetes tipo 2, y también se están cada vez más vinculados widiabetes tipo 1 ª. El presente ratón aislamiento de islotes y el protocolo de determinación de cAMP puede ser una herramienta para ayudar a delinear los mecanismos que promueven la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas, en particular los que están mediadas por los receptores de la incretina o receptores que actúan a través de la modulación de la producción de cAMP intracelular relacionado. Si bien sólo se describirán las medidas de cAMP, el protocolo de aislamiento de islotes descrito crea una preparación limpia que permite también para muchas otras aplicaciones posteriores, incluyendo la glucosa estimula la secreción de insulina, [3 H]-timidina incorporación, la abundancia de proteínas, y la expresión del ARNm.
Introduction
El mantenimiento estricto de euglucemia es imperativo para prevenir la morbilidad como la neuropatía, nefropatía y retinopatía, que son todas las características de la patología de la diabetes 1 no controlada de tipo 1 y 2. Disminución de la función de las células β y la masa, tanto en la diabetes tipo 1 y 2 perturban las concentraciones de glucosa en la sangre 2. Considerando que el tipo inmunomediada 1 diabetes resulta de una devastadora pérdida de β-células productoras de insulina, la secreción de insulina de las células β alterada y la señalización de la insulina periférica en la diabetes tipo 2 en conjunto promueven la hiperglucemia, la dislipidemia y aumento de la producción hepática de glucosa, lo que finalmente se traduce en tanto la pérdida de la capacidad de la masa de células β y secretora de insulina a partir de β-células individuales 3. La comprensión de los mecanismos de las células β subyacentes en la progresión de la diabetes tipo 1 y 2 con suerte, dará lugar a nuevas terapias para prevenir y tratar estas enfermedades.
En ti vitromodelos de cultivo ncidencia, como el INS-1 y MIN6 inmortalizados líneas de células β, pueden ser herramientas útiles para la comprensión de las funciones específicas de las células β. Sin embargo, las interacciones entre los diferentes tipos de células dentro de la isleta pueden ellos mismos regular la función de las células β. Por ejemplo, la influencia paracrina de glucagón (liberado de α-células) y la somatostatina (liberado de las células δ) en el aumento y la disminución de la secreción de insulina, respectivamente, demuestra la importancia de la proximidad de células de células en la respuesta endocrina 4. Por otra parte, los cruces brecha entre β-células potencian la liberación de insulina 5. Además, si bien se ha avanzado en la generación de líneas de insulinoma que mejor replican la respuesta fisiológica de los islotes aislados en glucosa (por ejemplo, el INS-1 derivado de 832/13 y 832/3 líneas celulares), su capacidad de respuesta de la glucosa aún difiere de rata normal islotes 6,7. Por otra parte, la respuesta de estas líneas celulares de insulinoma clonalesa péptido-1 (GLP-1) agonistas de tipo glucagón puede diferir drásticamente el uno del otro, así como de los islotes normales 6. Por lo tanto, las líneas de células inmortalizadas pueden no representar el mejor modelo para ensayar agentes que influyen en la producción de cAMP.
En contraste con las líneas celulares de insulinoma-derivado, el estudio de la función de células β únicamente en modelos animales enteros ofrece su propio conjunto de complicaciones. Uno de los mayores retos en el trabajo con el tejido endocrino es la medición de la concentración exacta de la hormona liberada. En concreto, el hígado juega un papel importante el metabolismo de la insulina, y el flujo de sangre páncreas va directamente al hígado. Por lo tanto, una medición de la insulina en plasma no puede representar con precisión las cantidades de insulina secretada por el páncreas en sí o el impacto de diferentes tratamientos sobre la tasa de secreción de insulina 8. Además, el metabolismo renal de glucagón puede limitar la fiabilidad de la producción de glucagón de las células de los islotes α-9. Por lo tanto, el aislamiento de islotes primarios de ratón para la experimentación in vitro proporciona una comprensión más precisa de cómo el islote está respondiendo a los estímulos específicos para complementar las mediciones realizadas in vivo.
El presente protocolo para el aislamiento de islotes de ratón es un protocolo bien establecido utilizado por varios grupos (con ligeras modificaciones que pueden ayudar a aumentar el éxito) 10,11. Además, la determinación de la producción de cAMP permite una lectura directa de la capacidad de respuesta de la incretina de las células β. En conjunción con la medición de AMPc, contenido de proteína y la secreción de insulina también se puede cuantificar a partir de la misma preparación de muestras de cAMP, lo que ayuda a determinar si un defecto en la función de las células β se encuentra proximal o distal a AMPc 10. El contenido de cAMP final y aplicación secreción de insulina en este protocolo puede ser una herramienta muy poderosa para la comprensión de la influencia de los componentes farmacéuticos y alimenticios, entre otross, el cAMP y la secreción de insulina. Además de la estimulación de glucosa sola, otros compuestos pueden ser utilizados para medir los cambios en el AMPc y la secreción de insulina 10,11.
Por último, aunque la insulina es la principal hormona que del ensayo de islotes aislados, otras hormonas, tales como glucagón y somatostatina, así como citoquinas, eicosanoides, y monofosfato de adenosina cíclico, puede también ser medido, ya sea mediante un ensayo de estimulación transitoria o por cuantificación de sus niveles en el medio de cultivo 12. Por último, aunque fuera del alcance de este manuscrito, aislamiento de islotes con el método de aislamiento de colagenasa descrito permite la preservación de los islotes de manera que muchas otras aplicaciones posteriores pueden llevarse a cabo, tales como el trasplante de islotes, el aislamiento de ARN para cuantitativa en tiempo real PCR o análisis de microarrays, proteínas aislamiento para el Western Blot, la incrustación de los islotes y de formación de imágenes de inmunofluorescencia, y la incorporación de [3H]-timidina como una medida de la replicación de células de islotescatiónico, algunos de los cuales se han descrito en artículos anteriores JoVE 13-16. En general, siguiendo el procedimiento de aislamiento de los islotes se describe en el protocolo puede proporcionar un investigador con información útil e importante para el desarrollo de terapias y promover el descubrimiento de medicamentos destinada a mejorar la función de las células β.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el predominio de la diabetes proyectados para afectar el 7,7% de la población mundial, la obligación de aplicar técnicas de investigación novedosas es imprescindible tanto para comprender y tratar la diabetes 18. El actual aislamiento de islotes es un protocolo bien establecido utilizado para la experimentación in vitro y se ha presentado con anterioridad, con ligeras modificaciones 11,14,16. Aunque la secreción de insulina es una aplicación común aguas abajo de islotes aislado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Renee L. Pasker y Harpreet K. Brar para la asistencia técnica de expertos sobre los protocolos descritos en este trabajo. Además, nos gustaría agradecer la tutoría de Christopher B. Newgard en la Universidad de Duke y Alan D. Attie en la Universidad de Wisconsin-Madison, junto con el apoyo de los miembros de su laboratorio, que nos permitió el tiempo y el apoyo necesarios para optimizar la protocolos descritos. En particular, agradecemos a Hans Hohmeier, Danhong Lu, y Helena Winfield en el Laboratorio Newgard y María Rabaglia en el Laboratorio Attie para los debates y asesoramiento de producción. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DK080845 y Diabetes Juvenil 594
Fundación de Investigación de subvención 17-2011-608 (a MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
References
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
