माउस अग्नाशय आइलेट अलगाव और intracellular शिविर निर्धारण के लिए एक विधि
Summary
लैंगरहैंस की पृथक माउस टापू का उपयोग इन विट्रो β सेल समारोह परख मधुमेह pathophysiology, और चिकित्सा विज्ञान के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण घटक है. कई बहाव के अनुप्रयोगों उपलब्ध हो रहे हैं, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से β सेल समारोह का निर्धारण एक आवश्यक पैरामीटर के रूप में intracellular चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) के माप का वर्णन करता है.
Abstract
अनियंत्रित glycemia मधुमेह की एक बानगी है और न्यूरोपैथी, अपवृक्कता, और रेटिनोपैथी तरह रुग्णता को बढ़ावा देता है. मधुमेह, प्रतिरक्षा की मध्यस्थता टाइप 1 और मोटापे से जुड़े टाइप 2 दोनों, मधुमेह pathophysiology और चिकित्सकीय तंत्र delineating के उद्देश्य से पढ़ाई की बढ़ती व्यापकता के साथ महत्वपूर्ण महत्व के हैं. लैंगरहैंस की अग्नाशय islets की β-कोशिकाओं उचित बुलंद रक्त ग्लूकोज सांद्रता के जवाब में इंसुलिन स्रावित के लिए जिम्मेदार हैं. ग्लूकोज और अन्य पोषक तत्वों, β-कोशिकाओं को भी विशिष्ट हार्मोन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं इसके अलावा, intracellular चक्रीय adenosine monophosphate का उत्पादन बढ़ाने कि β सेल रिसेप्टर्स पर एक भोजन और अधिनियम के जवाब में पेट से स्रावित होते हैं जो incretins, (करार दिया शिविर). कमी हुई β सेल समारोह, जन, और Incretin जवाबदेही टाइप 2 मधुमेह के pathophysiology के लिए योगदान करने के लिए अच्छी तरह से समझ रहे हैं, और भी तेजी वाई लिंक किया जा रहे हैंवें टाइप 1 मधुमेह. वर्तमान माउस आइलेट अलगाव और शिविर दृढ़ संकल्प प्रोटोकॉल रोग प्रगति और उपचारात्मक उपायों, intracellular शिविर उत्पादन के मॉडुलन के माध्यम से कार्य रिसेप्टर्स कि Incretin रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता या संबंधित हैं कि विशेष रूप से उन लोगों को बढ़ावा देने के तंत्र को चित्रित करने में मदद करने के लिए एक उपकरण हो सकता है. केवल शिविर माप वर्णित जाएँगे, वर्णित आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल भी ग्लूकोज इंसुलिन स्राव, [3 एच] thymidine निगमन, प्रोटीन बहुतायत, और mRNA अभिव्यक्ति प्रेरित सहित कई अन्य बहाव के अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है एक स्वच्छ तैयारी बनाता है.
Introduction
euglycemia की सख्त रखरखाव अनियंत्रित टाइप 1 और 2 मधुमेह 1 की विकृति के सभी पहचान कर रहे हैं जो इस तरह के न्यूरोपैथी, अपवृक्कता, और रेटिनोपैथी, के रूप में रुग्णता को रोकने के लिए जरूरी है. टाइप 1 और 2 मधुमेह दोनों में कम β सेल समारोह और बड़े पैमाने पर रक्त ग्लूकोज सांद्रता 2 उपद्रव. इंसुलिन के उत्पादन β-कोशिकाओं, बिगड़ा β सेल इंसुलिन स्राव और प्रकार में परिधीय इंसुलिन संकेतन 2 मधुमेह का एक विनाशकारी हानि से प्रतिरक्षा की मध्यस्थता टाइप 1 मधुमेह के परिणाम एक साथ hyperglycemia, dyslipidemia, और अंत में जो परिणाम में वृद्धि हुई यकृत ग्लूकोज उत्पादन को बढ़ावा देने, जबकि व्यक्तिगत β-3 कोशिकाओं से β सेल जन और इंसुलिन स्राव क्षमता की हानि. दोनों टाइप 1 और 2 मधुमेह की प्रगति में अंतर्निहित β सेल तंत्र को समझना उम्मीद है कि इन रोगों की रोकथाम और इलाज के लिए उपन्यास उपचार को जन्म देगा.
इन विट्रो ती मेंऐसे आईएनएस -1 और MIN6 रूप ssue संस्कृति मॉडल, β सेल लाइनों अमर विशिष्ट β सेल कार्यों को समझने के लिए उपयोगी उपकरण हो सकता है. हालांकि, आइलेट के भीतर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत के लिए खुद को β सेल समारोह को विनियमित करते हैं. उदाहरण के लिए, ग्लूकागन की पैराक्राइन प्रभाव (α-कोशिकाओं से जारी) और इंसुलिन स्राव में वृद्धि और कम करने में सोमेटोस्टैटिन (δ कोशिकाओं से जारी), क्रमशः, अंत: स्रावी प्रतिक्रिया 4 में सेल सेल निकटता के महत्व को दर्शाता है. इसके अलावा, β-कोशिकाओं के बीच अंतराल जंक्शनों इंसुलिन 5 की रिहाई की शक्ति प्रदान. प्रगति बेहतर ग्लूकोज में अलग islets की शारीरिक प्रतिक्रिया दोहराया कि insulinoma लाइनों पैदा करने में किया गया है, हालांकि इसके अलावा, (उदाहरण के लिए, आईएनएस-1-व्युत्पन्न 832/13 और 832/3 सेल लाइनों), उनके ग्लूकोज जवाबदेही अभी भी सामान्य चूहे से अलग है 6,7 आइलेट्स. इसके अलावा, इन प्रतिरूप insulinoma सेल लाइनों की प्रतिक्रियाग्लूकागन की तरह पेप्टाइड 1 (जीएलपी -1) एगोनिस्ट के लिए एक दूसरे से नाटकीय रूप से भिन्न है, साथ ही सामान्य टापू 6 से कर सकते हैं. इसलिए, अमर सेल लाइनों एजेंट शिविर उत्पादन पर प्रभाव है कि परख करने की क्रिया के लिए सर्वश्रेष्ठ अभिनेत्री का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं.
Insulinoma व्युत्पन्न सेल लाइनों के विपरीत, पूरे पशु मॉडल में केवल β सेल समारोह का अध्ययन जटिलताओं का अपना सेट प्रदान करता है. अंत: स्रावी ऊतक के साथ काम करने में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक जारी हार्मोन की सटीक एकाग्रता को मापने है. विशेष रूप से, जिगर इंसुलिन metabolizing एक प्रमुख भूमिका निभाता है, और अग्न्याशय रक्त प्रवाह जिगर को सीधे जाता है. इस प्रकार, एक प्लाज्मा इंसुलिन माप सही अग्न्याशय में ही या इंसुलिन स्राव 8 की दर पर विभिन्न उपचार के प्रभाव से स्रावित जा रहा इंसुलिन की मात्रा को चित्रित नहीं हो सकता है. इसके अलावा, ग्लूकागन के गुर्दे चयापचय आइलेट α कोशिकाओं 9 से ग्लूकागन उत्पादन की विश्वसनीयता सीमित कर सकता है. इसलिए, इन विट्रो प्रयोग के लिए प्राथमिक माउस टापू अलग आइलेट विवो में किए गए माप के पूरक के लिए विशिष्ट उत्तेजनाओं का जवाब है कि कैसे एक और अधिक सटीक समझ प्रदान करता है.
माउस islets के अलगाव के लिए मौजूद प्रोटोकॉल (सफलता को बढ़ाने के लिए मदद मिल सकती है कि मामूली संशोधनों के साथ) समूहों की एक संख्या 10,11 द्वारा प्रयोग किया जाता एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल है. इसके अलावा, इस शिविर उत्पादन के निर्धारण β कोशिकाओं की Incretin जवाबदेही का एक सीधा पढ़ने के लिए बाहर के लिए अनुमति देता है. शिविर माप, प्रोटीन सामग्री और इंसुलिन स्राव के साथ संयोजन के रूप में भी β सेल समारोह में एक दोष शिविर 10 को समीपस्थ या बाहर का निहित है कि यह निर्धारित करने में मदद ही शिविर नमूना प्रस्तुत करने से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में अंतिम शिविर सामग्री और इंसुलिन स्राव आवेदन दूसरे के बीच, दवा और आहार घटकों के प्रभाव को समझने के लिए एक बहुत शक्तिशाली उपकरण किया जा सकता हैएस, शिविर और इंसुलिन स्राव पर. अकेले ग्लूकोज से उत्तेजना के अलावा, अन्य यौगिकों शिविर और इंसुलिन स्राव 10,11 में बदलाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इंसुलिन हम अलग टापू, ऐसे ग्लूकागन और सोमेटोस्टैटिन के रूप में अन्य हार्मोन,, साथ ही साइटोकिन्स, eicosanoids, और चक्रीय adenosine monophosphate से परख प्राथमिक हार्मोन है, हालांकि अंत में, यह भी एक क्षणिक उत्तेजना परख द्वारा या की मात्रा का ठहराव के द्वारा या तो, मापा जा सकता है संस्कृति के माध्यम से 12 में अपने स्तर. अंत में, कई अन्य बहाव के अनुप्रयोगों जैसे आइलेट प्रत्यारोपण, पीसीआर या माइक्रोएरे विश्लेषण करती है मात्रात्मक वास्तविक समय के लिए शाही सेना अलगाव, प्रोटीन के रूप में, अपनाई जा सकता है, ताकि बाहर इस पांडुलिपि के दायरे से वर्णित collagenase अलगाव विधि के साथ आइलेट अलगाव आइलेट संरक्षण के लिए अनुमति देता है, हालांकि पश्चिमी सोख्ता, आइलेट embedding और Immunofluorescent इमेजिंग, और आइलेट सेल repli के एक उपाय के रूप में [3H] thymidine शामिल करने के लिए अलगावपिछले जौव लेख 13-16 में वर्णित किया गया है, जिनमें से कुछ केशन,. कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल में वर्णित आइलेट अलगाव प्रक्रिया के बाद चिकित्सा के विकास और β सेल समारोह को बढ़ाने के उद्देश्य से दवाओं की खोज को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण और उपयोगी जानकारी के साथ एक शोधकर्ता प्रदान कर सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
दुनिया की आबादी का 7.7% को प्रभावित करने का अनुमान मधुमेह के प्रसार के साथ, उपन्यास अनुसंधान तकनीकों की आवश्यकता दोनों को समझते हैं और मधुमेह 18 का इलाज करने के लिए आवश्यक है. वर्तमान आइलेट अलगाव में ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल पर विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए रेनी एल Pasker और हरप्रीत लालकृष्ण बराड़ को धन्यवाद देना चाहूंगा. इसके अलावा, हम हमारे समय की अनुमति दी जो उनकी प्रयोगशाला के सदस्यों के समर्थन के साथ, मैडिसन विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय में ड्यूक विश्वविद्यालय और एलन डी. Attie पर क्रिस्टोफर बी Newgard की सलाह स्वीकार करते हैं और अनुकूलन करने के लिए आवश्यक समर्थन करना चाहते हैं वर्णित प्रोटोकॉल. विशेष रूप से, हम उत्पादक विचार विमर्श और सलाह के लिए Attie प्रयोगशाला में हंस Hohmeier, Danhong लू, और हेलेना Winfield Newgard प्रयोगशाला में और मैरी Rabaglia धन्यवाद. इस काम एनआईएच अनुदान DK080845 और किशोर मधुमेह 594 द्वारा समर्थित किया गया
(खल्क के लिए) रिसर्च फाउंडेशन अनुदान 17-2011-608
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
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