En metode for mus bukspyttkjertelens Isolering og Intracellulær cAMP Bestemmelse
Summary
Analysere in vitro β-cellefunksjon ved hjelp av isolerte mus Langerhanske øyer er en viktig komponent i studiet av diabetes patofysiologi og behandlingsformer. Mens mange nedstrøms applikasjoner som er tilgjengelige, denne protokollen beskriver spesielt måling av intracellulær cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) som en viktig parameter å bestemme β-cellefunksjon.
Abstract
Ukontrollert glykemi er et kjennetegn på diabetes mellitus og fremmer lidelser som nevropati, nefropati og retinopati. Med den økende forekomsten av diabetes, både immun-mediert type 1 og fedme bundet type 2, studier rettet mot å avsløre diabetes patofysiologi og terapeutiske mekanismer er av avgjørende betydning. De β-cellene i de pankreatiske Langerhanske øyer er ansvarlig for riktig sekresjon insulin i respons til forhøyede blodglukosekonsentrasjoner. I tillegg til glukose og andre næringsstoffer, er β-celler også stimulert av spesifikke hormoner, betegnet Inkretinene, som utskilles fra tarmen som respons på et måltid, og virker på β-cellereseptorer som øker produksjonen av intracellulær cyklisk adenosin monofosfat ( cAMP). Redusert β-cellefunksjon, masse og inkretinsystemet respons er godt forstått å bidra til patofysiologien av type 2 diabetes, og blir også i økende grad knyttet with type 1 diabetes. Den nåværende mus holme isolasjon og cAMP besluttsomhet protokollen kan være et verktøy for å hjelpe avgrense mekanismer fremme sykdomsutvikling og terapeutiske intervensjoner, spesielt de som er mediert av de inkretin reseptorer eller relaterte reseptorer som fungerer gjennom modulering av intracellulær cAMP produksjon. Mens bare cAMP-måling vil bli beskrevet, gir den beskrevne holme isolasjonsprotokoll et rent preparat som også gir mulighet for mange andre nedstrøms applikasjoner, inkludert glukosestimulert insulinsekresjon, [3H]-thymidin-inkorporering, protein overflod, og mRNA-ekspresjon.
Introduction
Den strenge vedlikehold av euglycemia er viktig å forebygge tilleggslidelser som nevropati, nefropati og retinopati, som er alle kjennetegn på patologi ukontrollert type 1 og 2 diabetes 1. Redusert β-cellefunksjon og masse i både type 1 og 2 diabetes forstyrre blodglukosekonsentrasjonen to. Mens immun-mediert type 1 diabetes resultater fra en knusende tap av insulinproduserende β-celler, nedsatt β-celle insulinsekresjon og perifer insulinsignalering i type 2 diabetes sammen fremme hyperglykemi, dyslipidemi, og økt glukoseproduksjon, noe som til slutt resulterer i både tap av β-cellemasse, og insulin sekretorisk kapasitet fra individuelle β-celler tre. Forstå de underliggende β-cellemekanismer i utviklingen av type 1 og 2 diabetes vil forhåpentligvis gi opphav til nye behandlingsformer for å forebygge og behandle disse sykdommene.
In vitro tissue kulturmodeller, slik som i Ins-1 og MIN6 udødelig β-cellelinjer, kan være nyttige verktøy for å forstå spesifikke β-cellefunksjoner. Men samspillet mellom de ulike celletyper innenfor holmen kan selv regulere β-cellefunksjon. For eksempel den parakrine påvirkning av glukagon (frigitt fra α-celler) og somatostatin (gitt ut fra δ-celler) i økende og avtagende insulinsekresjon, henholdsvis, demonstrerer viktigheten av celle celle nærhet i det endokrine respons 4.. Videre gap veikryss mellom β-celler potensere frigjøring av insulin fem. Videre, selv om fremskritt har blitt gjort i å generere insulinoma linjer som bedre replikert den fysiologiske responsen av isolerte øyer på glukose (f.eks Ins-1-avledet 832/13 og 832/3-cellelinjer), deres glukoserespons fremdeles er forskjellig fra normale rotte holmer 6,7. Videre reaksjon av disse klonale insulinoma cellelinjertil glukagon-lignende peptid-1 (GLP-1)-agonister kan variere betydelig fra hverandre, så vel som fra vanlige holmer 6. Derfor kan udødeliggjorte cellelinjer ikke representere den beste modellen for bestemmelse av stoffer som påvirker cAMP-produksjon.
I motsetning til de insulinoma-avledede cellelinjer, studere β-cellefunksjonen utelukkende i hele dyremodeller har sitt eget sett av komplikasjoner. En av de største utfordringene i arbeidet med endokrine vev er å måle den nøyaktige konsentrasjonen av hormonet frigjøres. Nærmere bestemt, spiller lever en stor rolle metaboliserende insulin, og bukspyttkjertelen blodstrømmen går direkte til leveren. Således kan en plasmainsulin målingen ikke nøyaktig fremstille de mengder insulin blir utskilles fra bukspyttkjertelen i seg selv, eller virkningen av forskjellige behandlinger på forekomsten av insulinsekresjon 8.. Videre kan renal metabolisme av glukagon begrenser påliteligheten av glukagon utgangen fra holmen α-celler 9. Derfor isolere primære muse holmer for in vitro eksperimentering gir en mer presis forståelse av hvordan holmen reagerer på bestemte stimuli for å utfylle målinger gjort i vivo.
Den nåværende protokoll for isolering av mus holmer er et veletablert protokoll som brukes av en rekke grupper (med små modifikasjoner som kan bidra til å øke suksess) 10,11. I tillegg tillater bestemmelse av cAMP-produksjon for en direkte avlesing av inkretinsystemet respons fra β-celler. I forbindelse med cAMP-måling, proteininnhold og insulinsekresjon kan også kvantifiseres fra samme cAMP prøven prep, bidrar til å bestemme om en feil i β-cellefunksjon ligger ved eller i avstand cAMP 10.. Den endelige cAMP innhold og insulinsekresjon program i denne protokollen kan være et svært kraftig verktøy for å forstå påvirkning av farmasøytiske og kosttilskudd bestanddeler, blant annets, på cAMP og insulinutskillelse. I tillegg til stimulering av glukose alene, kan andre forbindelser benyttes for å måle endringer i cAMP and insulin secretion 10,11.
Til slutt, selv om insulin er den primære hormon vi analysen fra isolerte holmer, andre hormoner, for eksempel glukagon og somatostatin, så vel som cytokiner, eikosanoider og cyklisk adenosinmonofosfat, kan også måles, enten ved en forbigående stimulering assay eller ved kvantifisering av sine nivåer i kulturmediet 12.. Til slutt, selv utenfor rammen av dette manuskriptet, holme isolasjon med den beskrevne collageisolasjonsmetoden gjør det mulig for holme bevaring slik at mange andre nedstrøms programmer kan bli forfulgt, for eksempel holme transplantasjon, RNA isolering for kvantitativ real-time PCR eller microarray-analyser, protein isolasjon for Western blotting, holme embedding og immunofluorescent bildebehandling, og [3H]-tymidininkorporering som et mål på holme celle replikation, hvorav noen er blitt beskrevet i tidligere JOVE området 13-16. Totalt, etter holmen isolasjon prosedyren som er beskrevet i protokollen kan gi en forsker med viktig og nyttig informasjon for å utvikle behandlingsformer og fremme medisiner rettet mot å forbedre β-cellefunksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med utbredelsen av diabetes anslått til å påvirke 7,7% av verdens befolkning, er kravet om nye forskningsteknikker viktig å både forstå og behandle diabetes 18. Den nåværende holme isolasjon er et veletablert protokollen som brukes for in vitro eksperimentering og har blitt presentert tidligere med litt modifikasjoner 11,14,16. Selv insulinsekresjon er en vanlig nedstrøms søknad om isolerte øyer, med fokus på oppstrøms bestanddeler, for eksempel cAMP, kan bidra til å avgrense…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Renee L. Pasker og Harpreet K. Brar for sakkyndig teknisk bistand på protokollen beskrevet i dette arbeidet. Videre ønsker vi å erkjenne veiledning av Christopher B. Newgard ved Duke University og Alan D. Attie ved University of Wisconsin-Madison, sammen med støtte fra sine laboratorie medlemmer, som tillot oss tid og støtte som er nødvendig for å optimalisere beskrevet protokoller. Spesielt vil vi takke Hans Hohmeier, Danhong Lu, og Helena Winfield i Newgard Laboratory og Mary Rabaglia i Attie Laboratory for produktive diskusjoner og råd. Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend DK080845 og Juvenile Diabetes 594
Research Foundation stipend 17-2011-608 (til MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
References
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
