En metod för mus bukspottkörtel Islet Isolering och intracellulär cAMP Fastställande
Summary
Analys in vitro-β-cellsfunktion med hjälp av isolerade mus Langerhanska öar är en viktig komponent i studiet av diabetes patofysiologi och terapi. Medan många tillämpningar nedströms finns tillgängliga, detta protokoll beskriver specifikt mätning av intracellulärt cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) som en väsentlig parameter bestämning β-cellsfunktion.
Abstract
Okontrollerad glycemia är ett kännetecken för diabetes mellitus och främjar morbiditet såsom neuropati, nefropati och retinopati. Med den ökande förekomsten av diabetes, både immunmedierad typ 1 och fetma bunden typ 2, studier som syftar till att avgränsa diabetes patofysiologi och terapeutiska mekanismer är av avgörande betydelse. Den β-cellerna hos de pankreatiska Langerhanska cellöarna är ansvariga för att på lämpligt sätt utsöndra insulin som svar på förhöjda blodglukoskoncentrationer. Förutom till glukos och andra näringsämnen, är β-celler också stimuleras av specifika hormoner, benämnd inkretiner, som utsöndras från tarmen som svar på en måltid och agera på β-cellreceptorer, som ökar produktionen av intracellulär, cyklisk adenosinmonofosfat ( cAMP). Minskade β-cellsfunktionen, massa, och incretin lyhördhet är väl förstått att bidra till patofysiologin vid typ 2-diabetes, och är också alltmer kopplat wie typ 1-diabetes. Den nuvarande mus holme isolering och cAMP beslutsamhet protokoll kan vara ett verktyg för att beskriva sådant som gynnar sjukdomsutveckling och terapeutiskt syfte, särskilt de som förmedlas av inkretiner receptorer eller relaterade receptorer som verkar genom modulering av intracellulär cAMP-produktion. Medan endast cAMP-mätningar kommer att beskrivas, skapar den beskrivna holme isolering protokoll ett rent preparat som också möjliggör för många andra tillämpningar i senare led, inklusive glukosstimulerad insulinsekretion, [3H]-tymidininkorporering, proteinhalten och mRNA-uttryck.
Introduction
Den strikta underhåll av euglycemia är absolut nödvändigt för att förhindra följdsjukdomar såsom neuropati, nefropati och retinopati, som är alla kännetecken för patologi okontrollerad typ 1 och 2 diabetes 1. Minskad β-cellsfunktion och massa i både typ 1 och 2 diabetes störa blodsockernivån 2. Av följande skäl immunmedierad typ 1-diabetes beror på en förödande förlust av insulinproducerande β-celler, nedsatt β-cellsinsulinsekretion och perifer insulinsignalering i typ 2-diabetes tillsammans främja hyperglykemi, dyslipidemi, och ökad glukosproduktionen i levern, vilket så småningom leder till både förlust av β-cellmassan och insulinsekretionskapacitet från enskilda β-celler 3. Att förstå de underliggande β-cellmekanismer i utvecklingen av typ 1 och 2 diabetes kommer förhoppningsvis att ge upphov till nya terapier för att förebygga och behandla dessa sjukdomar.
In vitro-tissue kulturmodeller, såsom INS-1 och MIN6 förevigat β-cell-linjer, kan vara användbara verktyg för att förstå specifika β-cellfunktioner. Men samspelet mellan de olika celltyper inom holmen kan själva reglera β-cellsfunktion. Till exempel den parakrina påverkan av glukagon (utsläppt från α-celler) och somatostatin (utsläppt från δ-celler) i ökande och minskande insulinutsöndring, respektive, visar på betydelsen av cellcell närhet i det endokrina svaret 4. Vidare kanalförbindelser mellan β-celler potentierar frisättningen av insulin 5. Även om framsteg har gjorts i att generera insulinomceller linjer som bättre replike det fysiologiska svaret av isolerade cellöar till glukos (t.ex., INS-1-härlett 832/13 och 832/3-cellinjer i) skiljer sin glukos responsiveness fortfarande från normal råtta cellöar 6,7. Dessutom svaret av dessa klonala insulinoma cellinjertill glukagon-liknande peptid-1 (GLP-1) agonister kan skilja sig dramatiskt från varandra, liksom från normala öar 6. Därför kan odödliga cellinjer representerar inte den bästa modellen för analys av ämnen som påverkar cAMP produktion.
I motsats till de insulinoma-härledda cellinjer, studera β-cellsfunktion endast i hela djurmodeller har sin egen uppsättning av komplikationer. En av de största utmaningarna i arbetet med endokrin vävnad mäter den exakta koncentrationen av hormon som frigörs. Specifikt spelar levern en viktig roll metaboliserande insulin, och bukspottkörteln blodflödet går direkt till levern. Således kan en mätning plasmainsulin inte exakt beskriva de mängder insulin som utsöndras från bukspottkörteln i sig eller effekterna av olika behandlingar på graden av insulinutsöndring 8. Dessutom kan njur metabolism av glukagon begränsa tillförlitligheten glukagon ut från ö-α-celler 9. Därför isolera primära mus holmar för in vitro-experiment ger en mer exakt förståelse av hur holmen svarar på specifika stimuli för att komplettera mätningar som gjorts in vivo.
Det nuvarande protokollet för isolering av mus holmar är ett väletablerat protokoll som används av ett antal grupper (med smärre ändringar som kan bidra till att öka framgång) 10,11. Dessutom kan bestämningen av cAMP-produktion möjliggör en direkt avläsning av den incretinen responsiveness av β-cellerna. I samband med cAMP-mätning, proteinhalt och insulinsekretion också kan kvantifieras från samma cAMP prov prep, hjälper till att bestämma huruvida en defekt i β-cellfunktion ligger proximalt eller distalt i förhållande till cAMP-10. Den slutliga cAMP innehåll och insulinsekre tillämpning i detta protokoll kan vara ett mycket kraftfullt verktyg för att förstå påverkan av läkemedel och kost beståndsdelar, bland annats, den cAMP-och insulinutsöndring. Förutom stimulans från enbart glukos, kan andra föreningar användas för att mäta förändringar i cAMP-och insulinutsöndring 10,11.
Slutligen, även om insulin är det primära hormonet vi analysera från isolerade cellöar, andra hormoner såsom glukagon och somatostatin, samt cytokiner, eikosanoider och cykliskt adenosinmonofosfat, kan också mätas, antingen genom en transient stimuleringsanalys eller genom kvantifiering av deras nivåer i odlingsmedium 12. Slutligen, även utanför ramen för detta manuskript, holme isolering med den beskrivna kollagenas isoleringsmetoden möjliggör holme bevaras så att många andra tillämpningar i efterföljande led kan bedrivas, t.ex. ö-transplantation, RNA-isolering för kvantitativ realtids-PCR och microarray-metoder, protein isolering för Western blotting, holme inbäddning och immunofluorescens avbildning, och [3H]-tymidininkorporering som ett mått på holme cell replikatjon, varav en del har beskrivits i tidigare jove artiklar 13-16. Sammantaget kan följa den lilla ön isoleringsförfarande som beskrivs i protokollet ger en forskare med viktig och användbar information för att utveckla terapier och främja läkemedelsutveckling syftar till att öka β-cellsfunktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med förekomsten av diabetes projekterade att påverka 7,7% av världens befolkning, är kravet på nya forskningsmetoder absolut nödvändigt att både förstå och behandla diabetes 18. Den nuvarande holme isolering är ett väletablerat protokoll som används för in vitro-experiment och har presenterats tidigare med smärre ändringar 11,14,16. Även insulinsekretion är en vanlig nedströms ansökan om isolerade öar, med fokus på uppströms beståndsdelar, såsom cAMP, kan hjälpa b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Renee L. Pasker och Harpreet K. Brar för teknisk experthjälp på protokollen i detta arbete. Dessutom vill vi tacka för det mentorskap av Christopher B. Newgard vid Duke University och Alan D. Attie vid University of Wisconsin-Madison, tillsammans med stöd av sina laboratorie medlemmar, som tillät oss tid och stöd som krävs för att optimera beskrivna protokoll. Framför allt tackar vi Hans Hohmeier, Danhong Lu, och Helena Winfield i Newgard Laboratory och Mary Rabaglia i Attie Laboratoriet för produktiva diskussioner och rådgivning. Detta arbete stöddes av NIH bidrag DK080845 och Juvenile Diabetes 594
Research Foundation 17-2011-608 (MEK)
Materials
| Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 |
| 5ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 |
| 1ml BD syringe | BD | 309628 |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 |
| 2-2-2 tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 |
| CaCl2 *2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| MgSO4 *7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
References
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
- Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
- Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
- Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
- Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
- Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
- Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
- Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
- Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
- Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
- Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
- Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
- Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
- Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
- Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
- Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).
