Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen
Summary
Wij een reproduceerbare werkwijze voor type 1 diabetes (T1D) bij de muis binnen twee weken adoptieve overdracht van eilandjescellen antigeen-specifieke primaire CD4 + T-cellen.
Abstract
De nonobese diabetische (NOD) muis ontwikkelt spontaan auto-immune diabetes na 12 weken oud en is de meest uitgebreid bestudeerde diermodel voor menselijke type 1 diabetes (T1D). Celoverdracht studies in bestraalde ontvanger muizen hebben aangetoond dat T-cellen zijn cruciaal bij T1D pathogenese in dit model. We beschrijven hier een eenvoudige methode om snel induceren T1D door adoptieve overdracht van gezuiverde primaire CD4 + T-cellen van pre-diabetische NOD muizen transgeen voor het eilandje T cel receptor (TCR) BDC2.5 in NOD.scid ontvangende muizen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat isolatie en adoptieve overdracht van diabetogene T-cellen kan worden voltooid binnen dezelfde dag, wordt bestraling van de ontvangers niet vereist, en een hoge incidentie van type 1 wordt opgewekt binnen 2 weken na de T-cel-overdracht. Aldus kan studies pathogenese en therapeutische interventies bij T1D plaatsvinden bij een hogere snelheid dan bij werkwijzen die berusten op heterogene T cel populaties of klonenafgeleid van diabetische NOD muizen.
Introduction
De NOD muis ontwikkelt auto-immune diabetes spontaan en is op grote schaal gebruikt als diermodel voor menselijke T1D 1,2. Pathogenese van type 1 in NOD muizen gekenmerkt door infiltratie, beginnend op 3-4 weken oud, van de pancreatische eilandjes van Langerhans door dendritische cellen en macrofagen, gevolgd door T-en B-cellen. Deze fase van niet-destructieve peri-insulitis leidt tot een langzame, progressieve vernietiging van insuline-producerende pancreatische β cellen, resulterend manifeste diabetes wordt 4-6 maanden 3. Overdracht van splenocyten 4,5, 6,7 of CD4 + CD8 + T-cellen van 8,9 diabetische NOD muizen is aangetoond dat diabetes bemiddelen in immuungecompromitteerde NOD muizen, wat aangeeft dat eilandje-reactieve T-cellen spelen een centrale rol in T1D pathogenese. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, diabetes ontwikkeld in ontvangende muizen langzaam gedurende een aantal weken in deze studies. Ook verschillende T cel klonen, verkregen door tijdrovende en durekweken van diabetogene T-cellen, is gemeld diabetes mediëren enkele weken na overdracht ontvangende muizen 7,10. Met de beschikbaarheid van transgene muizen die TCR afgeleid van CD4-of CD8-diabetogenic beperkte T-celklonen, verschillende laboratoria hebben aangetoond dat vervolgens milt T-cellen van dergelijke muizen konden diabetes dragen aan ontvangers 11-13. Specifiek, BDC2.5 NOD muizen transgeen voor BDC2.5 TCR, die specifiek is voor chromogranine A, een eiwit in pancreatische bètacellen 14-16. Overdracht van in vitro-geactiveerde of niet-geactiveerde geheel of gefractioneerde miltcellen van openlijk diabetes of prediabetes BDC2.5 muizen overgebracht diabetes te neonatale of immunodeficiënte NOD muizen op verschillende efficiëntie 11,17-19.
We beschrijven een eenvoudige methode die gezuiverd transgene CD4 + T-cellen maakt gebruik van pre-diabetische BDC2.5 muizen te induceren T1D in de ontvangende muizen op een hoog rendement en consistentie. Grote aantallen naïeve eilandje antigeen-specifieke CD4 + T-cellen geïsoleerd uit deze muizen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor CD4 + CD62L + T cellen die het transgene TCR Vβ4 keten. Gezuiverd transgene T-cellen worden vervolgens overgedragen zonder activering in NOD.scid muizen, die functioneel T en B cellen missen en zijn insulitis-en diabetes-vrij 20. De ontvangende muizen worden gecontroleerd op verhoogde concentraties van urine glucose aangegeven T1D die snel ontwikkelt zich binnen twee weken na T celoverdracht.
In tegenstelling tot andere methoden overdragen diabetogenic T-cellen met heterogene specificiteiten ons protocol gebruikt FACS-gesorteerd CD4 + T-cellen die bijna uitsluitend de expressie diabetogenic BDC2.5 TCR. Door hun homogeniteit, slechts kleine aantallen overgedragen T-cellen (~ 1×10 6 cellen / muis) nodig voor een snelle ontwikkeling T1D binnen 2 weken 100% incidentie. Een ander voordeel van ons protocol is dat DOORSTRALI GSIn van ontvangende muizen is niet nodig omdat voor een aantal andere methoden. Een mogelijke beperking van deze methode is dat het niet het onderzoek naar de bijdrage van zowel CD4 en CD8 T-cel subsets of specifieke CD8 T-cellen in diabetes mogelijk.
De beschreven protocol handig voor het bestuderen T1D snelle ontwikkeling, gemedieerd door naïeve, mono-specifiek CD4 + T-cellen, alsook therapeutische strategieën voor interventie in homing van eilandjescellen antigeenspecifieke Th cellen het doelwitorgaan worden.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D kan worden geïnduceerd in ontvangende muizen met verschillende efficiëntie van adoptieve overdracht van gehele miltcellen of T-cel subsets van diabetische NOD muizen of muizen die transgeen zijn voor TCR afgeleid van diabetogenic T-celklonen. Wij rapporteren hier een reproduceerbare werkwijze voor het induceren T1D in ontvangende muizen binnen twee weken bij 100% incidentie van overdracht FACS-gezuiverde CD62L + BDC2.5 transgene CD4 + T cellen in NOD.scid-muizen.
Specifieke voordelen v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Robert Bonneau en Neil Christensen voor nuttig commentaar.
Dit werk werd ondersteund door de Pennsylvania State University College of Medicine fondsen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
