Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri
Summary
Biz adacık antigen spesifik primer CD4 + T-hücrelerinin adoptif transfer yoluyla, iki hafta içinde farenin tip 1 diyabet (tip 1 diyabetin) ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.
Abstract
Obez olmayan diyabetik (NOD) fare kendiliğinden yaş 12 hafta sonra otoimmün diyabet gelişir ve insan Tip 1 diyabet (T1D) en çok çalışılan hayvan modelidir. Işınlanmış alıcı farelerde hücre transferi çalışmaları T hücreleri bu modelde T1D patogenezinde önemli olduğunu kurduk. Hızla arıtılmış adoptif transfer yoluyla T1D endüklemek için burada basit bir yöntem tarif primer CD4 + NOD.SCID alıcı farelere adacık-spesifik T hücre reseptörü (TCR) BDC2.5 için transgenik pre-diyabetik NOD farelerde T hücreleri. Bu tekniğin en önemli avantajlarından aynı gün içinde, alıcıların ışınlama gerekli değildir, ve tip 1 diyabetin yüksek oranda T hücre transferinden sonra 2 hafta içinde ortaya çıkarılan bir diyabetojenik T hücrelerinin izolasyonu ve evlatlık transferi tamamlanabilir vardır. Böylece, T1D patogenez ve tedavi edici girişimlerin çalışmaları heterojen T hücre popülasyonlarının veya klonlar dayalı yöntemlere göre daha hızlı bir oranda devam edebilirsinizNOD farelerinde diyabet türetilmiştir.
Introduction
NOD farelerinde kendiliğinden otoimmün diyabet gelişir ve yaygın olarak insan tip 1 diyabetin 1,2 için bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. NOD farelerinde tip 1 diyabetin patogenezi T ve B hücreleri tarafından takip dendritik hücreler ve makrofajlar tarafından Langerhans pankreatik adacık arasında, yaş, 3-4 haftalık başlayarak, infiltrasyonu ile karakterize edilir. Tahribatsız peri-insülit Bu aşama 3 yaş arasında 4-6 ay belirgin diabetes ile sonuçlanan, insülin üreten pankreatik β hücre yavaş ilerleyen yok edilmesini sağlar. 4,5 splenositler, CD4 +, NOD farelerinde diyabet ikinci 6,7 veya CD8 + T hücreleri, 8,9 transferini adacık-reaktif T hücreleri, tip 1 diyabetin patojenezinde merkezi bir rol oynadığını gösteren, bağışıklık sistemi, NOD farelerinde diyabet aracılık ettiği gösterilmiştir. Deneysel koşullara bağlı olarak, diyabet bu çalışmalarda birkaç hafta boyunca, yavaş yavaş alıcı farelerde geliştirilmiştir. Benzer şekilde, çeşitli T hücresi klonları, zaman alıcı ve pahalı bir hesaplayarakdiyabetojenik T hücrelerinin kültürlenmesi, birkaç hafta alıcı farenin 7,10 içine transferinden sonra şeker hastalığı aracılık ettiği bildirilmiştir. CD4 veya CD8-kısıtlı diyabetojenik T hücresi klonları, birkaç laboratuar tarafından türetilen TCRS eksprese eden transgenik farelerin kullanılması ile daha sonra bu farelerin dalak T hücreleri 11-13 alıcıya diyabet aktarmak mümkün olduğunu göstermiştir. Özellikle, BDC2.5 NOD farelerinde kromogranin A, pankreatik beta hücreleri 14-16 bir protein için spesifik olan BDC2.5 TCR için transgenik olan. In vitro-aktif veya verimliliği 11,17-19 değişen yenidoğan veya bağışıklık yetersizliği NOD fareler diyabet transfer açıkça diyabetik veya prediyabetik BDC2.5 farelerin un-aktif tamamen veya fraksiyone dalak hücrelerinde devri.
Bu saflaştırılmış CD4 transgenik kullanan basit bir yöntem + yüksek verim ve müteşekkildi de alıcı farelerde T1D endüklemek için, pre-diyabetik BDC2.5 farenin alınan T hücreleri tanımlamakNCY. Naif, adacık antijene özgü CD4 + T hücrelerinin çok sayıda CD4 floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) TCR transjenik Vβ4 zincirini ifade + CD62L + T hücreleri, bu farelerden izole edilmiştir. Saflaştırılmış transgenik sonra T hücreleri fonksiyonel T ve B hücreleri eksikliği ve insülit ve şeker içermeyen 20 vardır NOD.SCID farenin içine aktivasyonsuz aktarılır. Alıcı fareler T hücre transferinden sonra iki hafta içinde hızla gelişir T1D, gösteren idrar glukoz konsantrasyonları için izlenir.
Heterojen özgünlükleri ile diyabetojenik T hücreleri aktarmak, bizim protokol FACS-sıralaması CD4 + neredeyse sadece diyabetojenik BDC2.5 TCR ifade T hücreleri kullandığı diğer yöntemler aksine. Homojenlikleri bağlı olarak, transfer T-hücreleri (1×10 ~ 6 hücre / fare) sadece çok az sayıda% 100 görülme az 2 hafta içinde hızlı bir tip 1 diyabetin gelişimi için gereklidir. Bizim protokol bir diğer avantajı irradiatio olanalıcı farenin n bazı diğer yöntemler için olduğu gibi gerekli değildir. Bu yöntemin özel bir potansiyel bir sınırlama hem CD4 ve CD8 T hücresi alt ya da özellikle diyabet ve CD8 T hücrelerinin katkı soruşturma izin olmamasıdır.
Açıklanan protokol hedef organa adacık antijen belirli Th hücreleri yuvalandırma müdahalede saf, monospesifik CD4 + T hücreleri, hem de tedavi edici stratejiler aracılığı ile oluşan hızlı bir tip 1 diyabetin gelişimi, çalışmak için yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tip 1 diyabetin, NOD farelerinde diyabet veya diyabetojenik T hücresi klonları elde TCRS için transgenik farelerden dalak hücreleri tamamen veya T hücre alt adoptif transfer yoluyla verimliliği değişen alıcı farelerde uyarılabilir. Bu tarifnamede NOD.SCID farelere FACS saflaştırılmış CD62L + BDC2.5 transgenik CD4 + T hücreleri,% 100 aktarma oranı iki hafta içinde alıcı farelerde T1D ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunulmaktadır.
BDC2.5 T hücre transferi mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. Yararlı yorumlar için Robert Bonneau ve Neil Christensen.
Bu çalışma Tıp fonların Pennsylvania State Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
