אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic
Summary
אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.
Abstract
סוכרתי עכבר nonobese (NOD) באופן ספונטני מתפתח סוכרת אוטואימונית לאחר 12 שבועות של גיל והוא מודל החיה נחקר רב ביותר מסוג אנושי סוכרת 1 (T1D). מחקרי תא העברה בעכברי נמען מוקרנים קבעו כי תאי T הם מרכזי בפתוגנזה T1D במודל זה. במסמך זה אנו מתארים שיטה פשוטה למהירות לגרום T1D ידי העברת מאמצת של מטוהרים, מסוג CD4 + T תאים ראשוניים מעכברי NOD טרום סוכרת מהונדסים לקולט איון הספציפי לתא T (TCR) BDC2.5 לעכברים נמען NOD.SCID. יתרונותיו העיקריים של טכניקה זו הם שבידוד והעברת מאמצת של תאי T diabetogenic יכולה להסתיים בתוך באותו היום, קרינה מהמקבלים אינה נדרשת, ושכיחות גבוהה של T1D הוא הושרה בתוך 2 שבועות לאחר העברת תאי T. כך, מחקרים של הפתוגנזה והתערבויות טיפוליות בT1D יכולים להמשיך בקצב מהיר יותר מאשר עם שיטות המסתמכות על אוכלוסיות תאי T הטרוגניים או שיבוטיםנגזר מעכברי NOD סוכרתיים.
Introduction
עכבר NOD מפתחת סוכרת אוטואימונית באופן ספונטני וכבר בשימוש נרחב כמודל חיה ל1,2 T1D האנושי. פתוגנזה של T1D בעכברי NOD מאופיינת בחדירה, החל משעת 3-4 שבועות של גיל, של איי הלבלב לנגרהנס על ידי תאי דנדריטים ומקרופגים, ואחריו T ותאי B. שלב זה של הלא הרסני פרי insulitis מוביל להרס איטי, הדרגתי של תאי β בלבלב, ייצור אינסולין, וכתוצאה מהסוכרת גלויה על ידי 4-6 חודשים של גיל 3. העברת splenocytes 4,5, מסוג CD4 + 6,7 או CD8 + 8,9 תאי T מעכברי NOD סוכרתיים הוכחו לתווך סוכרת בעכברי NOD חיסון, מצביע על כך שתאי T איון-reactive לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה T1D. בהתאם לתנאי הניסוי, פיתחה סוכרת בעכברי נמען לאט, במשך מספר שבועות במחקרים אלה. באופן דומה, שיבוטים תא T שונים, שהופקו על ידי זמן רב ויקרהculturing של תאי T diabetogenic, דווח לתווך סוכרת מספר שבועות לאחר העברה לעכברים נמען 7,10. עם הזמינות של עכברים הטרנסגניים לבטא TCRs נגזר מסוג CD4-או שיבוטים תא T diabetogenic CD8 מוגבלים, מספר מעבדות שלאחר מכן הראה כי תאי T טחול מעכברים כאלה היו מסוגלים להעביר את הסוכרת לנמענים 11-13. באופן ספציפי, BDC2.5 עכברי NOD הם מהונדס לBDC2.5 TCR, שהוא ספציפי לchromogranin, חלבון בתאים בטא בלבלב 14-16. העברת בשלם או מופרדים תאי טחול בלתי פעילים מBDC2.5 עכברי גלוי סוכרת או סוכרת prediabetic הועברו לעכברים NOD ילוד או immunodeficient ביעילות משתנה 11,17-19 מבחנה המופעל או.
אנו מתארים שיטה פשוטה שמנצלת מסוג CD4 + T מהונדס מטוהרים תאים מעכברי BDC2.5 טרום סוכרת לגרום T1D בעכברי נמען ביעילות וconsiste גבוהיםncy. מספר גדול של CD4 נאיבי, איון אנטיגן ספציפי + T תאים מבודדים מעכברים אלה על ידי מיון תא הקרינה המופעל (FACS) לסוג CD4 + CD62L + T תאים המבטאים את השרשרת המהונדס TCR Vβ4. מטוהרים תאי T מהונדסים מועברים לאחר מכן ללא הפעלה לעכברים NOD.SCID, אשר חוסר T תפקודי ותאי B ו-הם insulitis וסוכרת חופשי 20. את עכברי הנמען מנוטרים לריכוזים גבוהים של גלוקוז בשתן מעידים T1D, אשר מתפתח במהירות תוך שבועיים לאחר העברת תאי T.
בניגוד לשיטות אחרות שיעביר תאי T diabetogenic עם ספציפיות הטרוגניים, הפרוטוקול שלנו משתמש FACS-ממוין CD4 + תאי T שכמעט אך ורק מבטאים את BDC2.5 TCR diabetogenic. בשל ההומוגניות שלהם, רק מספר קטן של תאי T שהועברו (~ 1×10 6 תאים / עכבר) נדרשים לפיתוח T1D מהיר בתוך 2 שבועות ב 100% פגיעה. יתרון נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא שirradiation של עכברי נמען אינו הכרחית כפי שהיא לכמה שיטות אחרות. הגבלת פוטנציאל של שיטה זו היא שהיא אינה מאפשרת חקירת התרומה של CD4 ו CD8 תת תאי T או תאי T CD8 במיוחד בסוכרת.
הפרוטוקול המתואר יהיה שימושי לחקר התפתחות T1D מהיר, בתיווכו של נאיבי, מסוג CD4 + monospecific תאי T, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות להתערב בביות של תאי ה איון אנטיגן ספציפיים לאיבר המטרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
יכול להיגרם T1D בעכברי נמען ביעילות משתנה על ידי העברת מאמצת של תאים שלמים טחול או תת תאי T מעכברי NOD סוכרתיים או עכברים מהונדסים לTCRs נגזר משיבוטי תא T diabetogenic. אנו מדווחים בזאת שיטה לשחזור כדי לגרום T1D בעכברי נמען בתוך שבועיים ב -100% שכיחות ידי העברת CD62L + BDC2.5 CD4 מהונדס FACS המ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בני הזוג. רוברט בונו וניל כריסטנסן על הערות מועילות.
עבודה זו נתמכה על ידי מכללת פנסילבניה סטייט של קרנות רפואה.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
