عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية
Summary
ثقافة الخلية الأولية هي تقنية مفيدة لتحليل فئات معينة من السكان من الخلايا، لا سيما من أجنة الفئران المعدلة وراثيا في مراحل نمو محددة. هنا، يتم تشريح البطينين الجنينية وفصلها، والخرز الأجسام المضادة، مترافق الاعتراف وفصل الخلايا البطانية لمزيد من التحليل.
Abstract
ثقافة الخلية عززت بشكل كبير من قدرتنا على تقييم السكان من الخلايا الفردية في ظل ظروف ثقافة لا تعد ولا تحصى. بينما خطوط الخلايا خلد توفر مزايا كبيرة لسهولة استخدامها، وهذه خطوط الخلايا غير متوفرة لجميع أنواع الخلايا المحتملة. من خلال عزل الخلايا الأولية من منطقة محددة من الفائدة، ولا سيما من الماوس المعدلة وراثيا، ودراسات أكثر دقة لا يمكن أن يؤديها. الأسلوب الذي ينطوي على تشريح الأساسية للجهاز أو الجهاز الجزئي للاهتمام (مثل القلب أو منطقة محددة من القلب) والفصل بين الجهاز إلى الخلايا واحد. ثم يتم تحضين هذه الخلايا مع حبات مغناطيسية مترافق إلى الأجسام المضادة التي تعترف نوع من الخلايا في المصالح. الخلايا من الفائدة يمكن أن ثم تكون معزولة مع استخدام المغناطيس، مع التربسين الحضانة قصيرة الانفصال الخلايا من الخرز. ويمكن بعد هذه الخلايا المعزولة يكون مثقف وتحليلها كما تريد. وقد تم تصميم هذه التقنية في الأصل لجهاز الماوس الكبارو لكن يمكن زيادتها بسهولة إلى أسفل للاستخدام مع أجهزة الجنينية، كما هو موضح هنا. لأن مصلحتنا هي في الأوعية الدموية التاجية النامية، أردنا أن دراسة هذه الفئة من السكان من الخلايا الجنينية خلال مراحل محددة. وهكذا، فإن البروتوكول الأصلي إلى تعديل لتكون متوافقة مع صغر حجم البطينين الجنينية والعائد قدرة منخفضة من الخلايا البطانية في هذه المراحل التنموية. الاستفادة من هذا النهج تحجيم، قمنا بتقييم التاجي الضفيرة إعادة عرض في المعدلة وراثيا الجنينية الخلايا البطانية البطين.
Introduction
ظهور خطوط الخلايا خلد قد أحدثت ثورة بيولوجيا الخلية الأساسية 1. وتستمد خطوط الخلايا المتوفرة حاليا من مجموعة واسعة من الأجهزة وتشمل جميع أنواع الخلايا الرئيسية. ومع ذلك، خطوط الخلايا التي أنشئت لديها بعض القيود. من الواضح أن عملية تخليد تغيير سلوك الخلايا، وتحديدا فيما يتعلق مدى الحياة والانتشار، ولكن يمكن أن تؤثر أيضا على التعبير عن البروتينات غير متوقعة، مثل البروتينات هيكل الخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا المختلفة المتاحة، وهناك تنوع كبير بين حتى نوع خلية واحدة داخل الكائن الحي بأكمله. الخلايا البطانية على وجه الخصوص تظهر السلوكيات المتنوعة سواء كانت تقوم على خط الشرايين أو الأوردة وأي نوع من تدفق موجود في السفينة 3. حتى أكثر إلحاحا من منظور إنمائي، ومع ذلك، هو أن الغالبية العظمى من خطوط الخلايا المتاحة مستمدة من أنسجة البالغين (انظر، على سبيل المثال خميسوقال انه جمع متاحة عبر آي تي سي سي). هذه خطوط الخلايا الكبار الأرجح لا ألخص الطبيعة الديناميكية لسلائفها الجنينية. ويتغير بسرعة الزمانية المكانية أنماط التعبير الجيني لوحظت خلال تطوير تشير أيضا إلى أن خلية البطانية من جهاز واحد في كل مرحلة تنموية معينة قد لا تتصرف بنفس الطريقة باعتبارها الخلية البطانية من نفس الجهاز في مرحلة تنموية مختلفة.
كبديل لاستخدام المتاحة تجاريا خطوط الخلايا خلده، الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة محددة من الفائدة. من بين مزايا هذه التقنية، وهذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن جهاز معين أو حتى جزء من الجهاز في أي مرحلة تنموية محددة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن مجموعة واسعة من الحيوانات المعدلة وراثيا المتوفرة، مما يتيح دراسة في المختبر من خروج المغلوب الجينات والضربة القاضية في حين تجنب مشاكل أخرى مثل كفاءة ترنسفكأيشن للفي. ليس من المستغرب، وكثيروقد نشرت تقنيات بالتفصيل كيفية عزل أنواع معينة من الخلايا 4،5. بشكل عام، هذه التقنيات تشمل جمع المنطقة من الفائدة، وعدم الربط بين الخلايا، ووضع علامات على نوع من الخلايا محددة من الفائدة، وعزل تلك الخلايا لمزيد من التحليل.
لدراسة السكان الجنينية المبكرة من الخلايا البطانية التاجي، ان قلصنا تقنية 4 التي تم نشرها مسبقا للاستخدام مع جهاز أصغر. مع هذا الإجراء تحجيم، يمكننا عزل الخلايا البطانية التاجية من القلب الجنينية في مراحل جنينية محددة. ويمكن بعد هذه الخلايا يمكن استخدامها في المقايسات البطانية التقليدية، مثل تحليلات الهجرة. حتى أوائل خطوط الخلايا الجنينية تصبح أكثر انتشارا، والعمل مع الخلايا الأولية هي تقنية لا تقدر بثمن.
Protocol
Representative Results
Discussion
العمل مع الخلايا الجنينية الأولية يسمح التجارب رواية لمعالجة في المختبر الخطوات الحاسمة للتنمية. ومع ذلك، فإن إجراء العزل ليست تافهة. وتشمل الخطوات الحاسمة لعزل أي نوع من الخلايا ضمان أن يتم فصل الخلايا بشكل جيد على الهضم كولاجيناز ثم أنهم علقت جيدا خلال خطوات ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر اندريا بورتبري لقراءة نقدية للمخطوطة، ومختبر خدمة مجهر UNC للحصول على المساعدة مع الوقت الفاصل بين التصوير، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة # R01HL061656) لدعم التمويل.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
- Landecker, H. . Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
