Выделение эмбриональных клетках эндотелия желудочков
Summary
Первичные культуры клеток является полезным методом для анализа конкретных популяций клеток, в частности из трансгенных эмбрионов мыши на определенных этапах своего развития. При этом эмбриональная желудочков расчленены и диссоциированных и антител конъюгированных бисера признать и выделить эндотелиальные клетки для дальнейшего анализа.
Abstract
Клеточные культуры в значительной степени повысить нашу способность оценивать отдельных популяций клеток в культуре множества условий. В то время как увековечены клеточных линий предлагают значительные преимущества для их простоту использования, эти клеточные линии недоступны для всех потенциальных типов клеток. При изоляции первичных элементов из определенной области интересов, в частности, от трансгенных мышей, больше нюансов исследования могут быть выполнены. Основной метод предполагает рассечение органа или частичном орган интерес (например, сердце или конкретной области сердца) и диссоциации органа отдельные клетки. Затем эти клетки инкубировали с магнитными шариками конъюгированным с антителом, которое распознает тип клеток, представляющих интерес. Интерес клетки могут быть затем выделена с использованием магнита, с короткой инкубации трипсин диссоциации клеток из шариков. Эти изолированные клетки могут быть затем культивировали и анализировали, как хотелось бы. Этот метод был первоначально разработан для взрослого органа мышис, но может быть легко уменьшено для использования с эмбриональных органов, как показано здесь. Поскольку наш интерес в развивающихся коронарных артерий, мы хотели изучить эту популяцию клеток в течение определенных эмбриональных стадиях. Таким образом, исходный протокол должен быть изменен, чтобы быть совместимым с небольшим размером эмбриональных желудочков и низким потенциалом выход эндотелиальных клеток на этих стадиях развития. Используя эту уменьшенную подход, мы оценили ремоделирования коронарных сплетения в трансгенных эмбриональных желудочка эндотелиальных клеток.
Introduction
Появление увековечены клеточных линиях революции основная клеточная биология 1. В настоящее время доступные клеточные линии, полученные из широкого круга органов и охватывает все основные типы клеток. Тем не менее, установлено клеточные линии имеют некоторые ограничения. Процесс иммортализацией очевидно изменяет поведение клеток, в частности в отношении продолжительности жизни и пролиферацию, но также может влиять на экспрессию неожиданный белки, такие как белки цитоскелета 2. Кроме того, хотя различные клеточные линии, которые доступны, существуют значительные различия между даже одного типа клеток в течение всего организма. Эндотелиальные клетки, в частности, разнообразные шоу поведения, на основании их линии артерий или вен и какой поток присутствует в емкости 3. Еще более актуальным с точки зрения развития, однако, является то, что подавляющее большинство из доступных клеточных линий, полученных из взрослых тканей (см., например TОн коллекции доступны через АТСС). Эти взрослые клеточные линии, вероятно, не повторять динамический характер их эмбриональные предшественники. Быстро меняется пространственно-временной экспрессии генов наблюдалось во время разработки также показывают, что эндотелиальные клетки от одного органа в данной стадии развития не может вести себя так же, как эндотелиальные клетки от одного органа на другой стадии развития.
В качестве альтернативы с использованием коммерчески доступных иммортализованных линий клеток, первичные элементы могут быть изолированы от конкретной ткани, представляющих интерес. Среди преимуществ этой техники, эти первичные клетки могут быть выделены из конкретного органа или части органа в любой конкретной стадии развития. Кроме того, эти первичные клетки могут быть выделены из широкого спектра доступных трансгенных животных, позволяя в пробирке изучение нокаут гена и нокаут в избегая при этом другие проблемы, такие как эффективность трансфекции. Неудивительно, что многиеметодов были опубликованы подробно, как изолировать специфические типы клеток 4,5. В общем, эти методы включают сбор области, представляющей интерес, диссоциации клеток, пометки конкретного типа клеток интереса, и выделение этих клеток для дальнейшего анализа.
Для изучения раннего эмбрионального населения коронарных эндотелиальных клеток, мы уменьшено ранее опубликованных методика 4 для использования с меньшим органа. С этим уменьшенную процедуру, мы можем изолировать коронарных эндотелиальных клеток из эмбрионального сердца в определенных эмбриональных стадиях. Эти клетки могут быть затем использованы в традиционных эндотелиальных анализов, таких как миграция анализов. До начала линий эмбриональных не стала более распространенной, работа с первичными клетками является бесценным технику.
Protocol
Representative Results
Discussion
Работа с первичной эмбриональных клеток позволяет разрабатывать новые эксперименты, чтобы обратиться в пробирке важных шагов развития. Тем не менее, процедуры выделения не является тривиальной. Критические шаги выделения любого типа клеток, включают обеспечение того, чтобы клет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Портбери за критическое прочтение рукописи, лабораторный микроскоп службы UNC за помощь в заданный промежуток времени, и НИЗ (грант № R01HL061656) для финансовой поддержки.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
- Landecker, H. . Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
