배아 심실 내피 세포의 분리
Summary
기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.
Abstract
세포 배양 크게 수많은 배양 조건에서 세포의 개별 인구를 평가하는 능력을 강화했다. 불후의 세포 라인 사용의 용이성에 상당한 이점을 제공하지만, 이러한 세포 라인은 모든 잠재적 세포 유형에 사용할 수 없습니다. 특히 형질 전환 마우스의 관심의 특정 지역의 일차 전지를 분리하여,보다 미묘한 연구를 수행 할 수 있습니다. 기본 기술은 장기 또는 그 일부 장기 (심장 또는 심장의 특정 지역 등) 해부 및 단일 세포로 장기 해리 포함한다. 이 세포는 그 관심의 세포 유형을 인식하는 항체 복합 자석 구슬로 배양한다. 그 세포는 그 구슬에서 세포를 해리 짧은 트립신 보육과, 자석의 사용으로 격리 할 수 있습니다. 이 고립 된 세포는 다음 배양하고 원하는 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 원래 성인 마우스의 장기를 위해 설계되었습니다들하지만, 쉽게 여기에서 알 수 있듯이, 배아 장기 사용하기 위해 아래로 확장 할 수 있습니다. 우리의 관심을 개발하는 관상 동맥 혈관에 있기 때문에, 우리는 특정 배아 단계에서 세포의이 인구를 공부했습니다. 따라서, 원래의 프로토콜은 배아 심실의 작은 크기와 이러한 발달 단계에서 내피 세포의 낮은 잠재적 인 수확량과 호환되도록 수정해야했습니다. 이 스케일 다운 방식 활용, 우리는 유전자 변형 배아 심실 내피 세포의 관상 동맥 신경 얼기 리모델링을 평가했다.
Introduction
불후의 세포 라인의 출현은 기본적인 세포 생물학 1 혁명을 일으켰다. 현재 세포주 기관의 다양한에서 파생 된 모든 주요 세포 유형을 포함하고 있습니다. 그러나 설립 세포 라인은 몇 가지 제한이 있습니다. 불멸화 과정은 분명히 특히 수명과 확산에 대해, 세포의 동작을 변경하지만, 또한이 세포 골격 단백질과 같은 예기치 않은 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 다른 세포 라인을 사용할 수 있지만 또한, 전체 유기체 내에서 단 한 번의 세포 유형 간의 유의 한 다양성이있다. 특히 쇼 다양한 행동의 내피 세포는 동맥이나 정맥 흐름의 종류는 용기 3에 존재하는 그들은 선 여부에 따라. 발달의 관점에서 훨씬 더 시급한 그러나, (참조, 예를 들면 t 사용할 수있는 세포 라인의 대부분이 성인 조직에서 파생 된 것입니다ATCC 통해 사용할 그가 컬렉션). 이러한 성인 세포주 가능성이 자신의 배아 전구체의 동적 특성을 요점을 되풀이하지 않습니다. 개발하는 동안 관찰 빠르게 변화하는 시공간 유전자 발현 패턴은 특정 발달 단계에서 하나의 기관에서 내피 세포가 다른 발달 단계에서 동일한 기관에서 내피 세포와 같은 방식으로 작동하지 않을 수 있습니다하는 것이 좋습니다.
시중 불후의 세포 라인을 사용하는 대신, 일차 전지는 관심의 특정 조직에서 분리 할 수 있습니다. 이 기술의 장점 가운데 이러한 기본 세포도 특정 기관이나 특정 발달 단계에서 기관의 부분으로부터 격리 할 수 있습니다. 또한, 이러한 기본 세포는 유전자 녹아웃 등의 transfection 효율성과 같은 다른 문제를 피하면서 노크에서의 체외 연구에서 허용 가능한 형질 전환 동물의 다양한 격리 할 수 있습니다. 되지 놀랍게도, 많은기술은 특정 세포 유형 4,5 분리하는 방법에 대해 자세히 발표되었다. 일반적으로,이 기술은 세포 태그 관심의 특정 세포 유형을 해리하고 추가 분석을 위해 그 세포를 분리, 관심의 영역을 모으는 포함한다.
관상 동맥 내피 세포의 초기 배아 인구를 연구하기 위해, 우리는 작은 장기 사용하기 위해 이전에 게시 된 기술 4 축소. 이 축소 된 절차로, 우리는 특정 배아 단계에서 배아 마음에서 관상 동맥 내피 세포를 분리 할 수 있습니다. 이러한 세포는 그런 마이그레이션 분석과 같은 전통적인 내피 분석에 사용할 수 있습니다. 초기 배아 세포 라인이 더 널리 될 때까지, 일차 전지 작업을하는 것은 매우 중요한 기술이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기본 배아 세포와 작업 새로운 실험 개발의 체외 중요한 단계에서 처리 할 수 있습니다. 그러나 분리 절차는 간단하지 않습니다. 세포의 모든 유형을 분리하는 중요한 단계는 세포가 잘 그들이 잘 세척 단계에서 중단되는 다음 콜라 소화에 분리되는 것을 보장 이용하실 수 있습니다. pipetting하여 기계적 박리 크게 콜라 단계에서 세포를 분리하는 데 도움이, 그리고 필터링 단계는 세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 중요한 원고 읽기, 시간 경과 이미징 지원 UNC의 현미경 서비스 연구소 및 자금 지원을위한 NIH (부여 # R01HL061656)의 안드레아 포트 베리에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
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