Aislamiento de células endoteliales embrionarias ventriculares
Summary
Cultivo celular primaria es una técnica útil para el análisis de poblaciones específicas de células, en particular a partir de embriones de ratones transgénicos en etapas de desarrollo específicas. En esto, los ventrículos embrionarias se disecan y se disociaron, y los granos de anticuerpos conjugados reconocen y se separan las células endoteliales para su posterior análisis.
Abstract
Cultivo celular ha mejorado en gran medida nuestra capacidad para evaluar las poblaciones individuales de las células bajo condiciones de cultivo innumerables. Mientras que las líneas celulares inmortalizadas ofrecen ventajas significativas para su facilidad de uso, estas líneas celulares no están disponibles para todos los tipos de células potenciales. Al aislar las células primarias de una región específica de interés, en particular de un ratón transgénico, se pueden realizar estudios más matizadas. La técnica básica consiste en la disección del órgano u órgano parcial de interés (por ejemplo, el corazón o de una región específica del corazón) y disociar el órgano a las células individuales. Estas células se incuban a continuación con perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo que reconoce el tipo de célula de interés. Las células de interés se pueden aislar con el uso de un imán, con una breve incubación con tripsina disociar las células de las perlas. Estas células aisladas pueden cultivarse a continuación, y se analizaron como se desee. Esta técnica fue diseñada originalmente para órgano ratón adultos pero se puede escalar fácilmente hacia abajo para su uso con órganos embrionarios, como se demuestra en este documento. Debido a que nuestro interés se centra en el desarrollo de la vasculatura coronaria, queríamos estudiar esta población de células durante las fases embrionarias específicas. Por lo tanto, el protocolo original tuvo que ser modificado para ser compatible con el pequeño tamaño de los ventrículos embrionarias y el bajo rendimiento potencial de las células endoteliales en estas etapas de desarrollo. Utilizando este enfoque a escala reducida, hemos evaluado la remodelación del plexo coronaria en las células endoteliales ventriculares embrionarias transgénicas.
Introduction
La llegada de las líneas celulares inmortalizadas ha revolucionado la biología celular básica 1. Las líneas celulares disponibles en la actualidad son derivados de una amplia gama de órganos y abarcan todos los tipos de células principales. Sin embargo, las líneas celulares establecidas tienen algunas limitaciones. El proceso de inmortalización, obviamente, cambia el comportamiento de las células, específicamente con respecto a la duración de la vida y la proliferación, sino que también puede afectar a la expresión de las proteínas inesperados, tales como las proteínas del citoesqueleto 2. Además, aunque muchos diferentes líneas celulares están disponibles, existe una diversidad significativa entre incluso un solo tipo de células dentro de un organismo entero. Las células endoteliales, en particular, muestran diversos comportamientos en función de si se alinean las arterias o las venas y el tipo de flujo está presente en el recipiente 3. Incluso más apremiante de una perspectiva de desarrollo, sin embargo, es que la gran mayoría de las líneas celulares disponibles se derivan de tejido adulto (ver, por ejemplo, tque de recogida disponible a través de ATCC). Estas líneas de células adultas probablemente no recapitulan la naturaleza dinámica de sus precursores embrionarios. El rápido cambio espacio-temporales patrones de expresión génica observados durante el desarrollo también sugieren que una célula endotelial de un órgano a la etapa de desarrollo determinado puede no comportarse de la misma manera que una célula endotelial a partir de ese mismo órgano en una etapa de desarrollo diferente.
Como una alternativa al uso de líneas celulares inmortalizadas disponibles comercialmente, las células primarias pueden ser aislados a partir del tejido específico de interés. Entre las ventajas de esta técnica, estas células primarias se pueden aislar a partir de un órgano específico o incluso parte de un órgano en cualquier etapa de desarrollo específico. Además, estas células primarias se pueden aislar a partir de la amplia variedad de animales transgénicos disponibles, lo que permite el estudio in vitro del gen knockout y knock-in evitando al mismo tiempo otros problemas tales como la eficiencia de transfección en. No es sorprendente que muchostécnicas se han publicado que detalla cómo aislar determinados tipos de células 4,5. En general, estas técnicas implican la recogida de la región de interés, disociar las células de marcado, el tipo específico de célula de interés, y el aislamiento de las células para su posterior análisis.
Para estudiar una población embrionario temprano de las células endoteliales coronarias, que en escala una técnica publicada previamente 4 para su uso con un órgano más pequeño. Con este procedimiento a escala reducida, podemos aislar las células endoteliales coronarias del corazón embrionario en las etapas embrionarias específicas. Estas células pueden entonces ser usados en ensayos de endoteliales tradicionales, tales como los análisis de migración. Hasta que las líneas de células embrionarias tempranas cada vez más frecuentes, en colaboración con las pilas es una técnica muy valiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación con células embrionarias primarias permite experimentos novedosos para abordar en etapas críticas del desarrollo in vitro. Sin embargo, el procedimiento de aislamiento no es trivial. Los pasos críticos para el aislamiento de cualquier tipo de células incluyen asegurar que las células están bien separados tras la digestión de colagenasa y luego de que están bien suspendidos durante los pasos de lavado. Disección mecánica mediante pipeteo en gran medida ayuda a separar las cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Andrea Portbury para la lectura crítica del manuscrito, el Laboratorio de Servicio de microscopio de UNC para obtener ayuda con el time-lapse y el NIH (subvención # R01HL061656) de apoyo financiero.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
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