Isolering af embryonale Ventrikulære endotelceller
Summary
Primær cellekultur er en nyttig teknik til at analysere specifikke populationer af celler, især fra transgene mus embryoner på bestemte udviklingstrin. Heri er embryonale ventrikler dissekeret og dissocieret, og antistof-konjugerede perler genkende og adskille endothelcellerne til yderligere analyse.
Abstract
Cellekultur har i høj grad forbedret vores evne til at vurdere de enkelte populationer af celler under myriader dyrkningsbetingelser. Mens udødeliggjorte cellelinjer giver betydelige fordele for deres brugervenlighed, disse cellelinjer er utilgængelige for alle potentielle celletyper. Ved at isolere primære celler fra et bestemt område af interesse, især fra en transgen mus, kan mere nuancerede undersøgelser skal udføres. Den grundlæggende teknik indebærer dissekere organet eller delvis organ af interesse (f.eks hjerte eller en specifik region i hjertet) og adskille orglet til enkelte celler. Disse celler inkuberes derefter med magnetiske perler konjugeret til et antistof, som genkender celletype af interesse. Cellerne af interesse kan derefter isoleres ved anvendelse af en magnet, med en kort trypsin inkubation dissociere cellerne fra perlerne. Disse isolerede celler kan derefter dyrkes og analyseres som ønsket. Denne teknik blev oprindeligt designet til voksne mus orgels men kan let skaleres ned til brug med embryonale organer, som demonstreret heri. Fordi vores interesse er i udviklingslandene koronar kar, vi ønskede at studere denne population af celler i bestemte fosterstadiet. Således den oprindelige protokol skulle ændres for at være forenelig med den lille størrelse af de embryonale hjertekamrene og den lave potentielle udbytte af endotelceller på disse udviklingsstadier. Udnytte denne nedskaleret tilgang har vi vurderet koronar plexus remodeling i transgene embryonale ventrikulære endotelceller.
Introduction
Fremkomsten af udødeliggjorte cellelinier har revolutioneret grundlæggende cellebiologi 1.. De nuværende tilgængelige cellelinier afledt fra en bred vifte af organer og omfatter alle de vigtigste celletyper. Men etablerede cellelinjer har nogle begrænsninger. Processen med immortalisering naturligvis ændrer opførslen af celler, især med hensyn til levetid og proliferation, men kan også påvirke ekspressionen af uventede proteiner, såsom cytoskeletproteiner 2. Desuden, selv om mange forskellige cellelinier er tilgængelige der er stor spredning blandt selv en enkelt celletype i en hel organisme. Endotelceller viser især forskellige adfærd baseret på om de linje arterier eller vener og hvilken form for strømning er til stede i beholderen 3.. Endnu mere presserende fra et udviklingsmæssigt perspektiv, er imidlertid, at størstedelen af de tilgængelige cellelinier afledt fra voksent væv (se f.eks tHan samling tilgængelig via ATCC). Disse voksne cellelinjer sandsynligt ikke gentage den dynamiske karakter af deres embryonale forstadier. De hurtigt skiftende spatiotemporale genekspressionsmønstre observeret under udviklingen antyder også, at en endotelcelle fra et organ på et givet udviklingstrin ikke kan opføre sig på samme måde som en endotelcelle fra samme organ på et andet udviklingstrin.
Som et alternativ til anvendelse af kommercielt tilgængelige udødeliggjorte cellelinier, kan primære celler isoleres fra de specifikke væv af interesse. Blandt fordelene ved denne teknik, kan disse primære celler isoleres fra et specifikt organ eller blot en del af et organ på noget bestemt udviklingsstadiet. Endvidere kan disse primære celler isoleres fra den brede vifte af tilgængelige transgene dyr, tillader in vitro-undersøgelse af gen-knockout og knock-in og samtidig undgå andre problemer såsom transfektionseffektivitet. Ikke overraskende mangeteknikker er blevet offentliggjort beskriver hvordan at isolere specifikke celletyper 4,5. Generelt indebærer disse teknikker indsamler regionen af interesse, dissocierende cellerne, tagging den specifikke celletype af interesse, og isolere disse celler til yderligere analyse.
At studere en tidlig embryonisk population af koronare endotelceller, vi skaleret ned en tidligere offentliggjort teknik 4 til anvendelse med en mindre orgel. Med denne nedskaleret procedure, kan vi isolere de koronare endotelceller fra embryonale hjerte på bestemte fosterstadiet. Disse celler kan derefter bruges i traditionelle endotel assays, såsom migration analyser. Indtil begyndelsen af embryonale cellelinjer bliver mere udbredt, der arbejder med de primære celler er en uvurderlig teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbejde med primære embryonale celler giver nye eksperimenter for at tage fat in vitro kritiske trin i udviklingen. Imidlertid isolation procedure er ikke trivielt. Kritiske trin til at isolere enhver type celler bl.a. sikre, at cellerne er godt adskilt på collagenasefordøjelse og så at de er godt suspenderet under vasketrinnene. Mekanisk dissektion ved pipettering i høj grad hjælper separere cellerne ved collagenase trin, og filtrering trin fjerner klumper af celler. Disse trin forbedring af befolkningen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Andrea Portbury for kritisk læsning af manuskriptet, mikroskop service Laboratorium UNC for assistance med time-lapse imaging og NIH (tilskuddet # R01HL061656) til finansiering support.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
- Landecker, H. . Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
