Isolering av embryonale Ventrikulære endotelceller
Summary
Primær cellekultur er en nyttig teknikk for å analysere spesifikke populasjoner av celler, spesielt fra transgene mus embryoer på bestemte utviklingsstadier. Heri, er embryonale ventriklene dissekert og distanserte, og antistoff-konjugert perler gjenkjenne og skille ut de endotelceller for videre analyse.
Abstract
Cellekultur har kraftig forbedret vår evne til å vurdere enkelte populasjoner av celler etter utallige kultur forhold. Mens udødeliggjort cellelinjer gi betydelige fordeler for sin brukervennlighet, disse cellelinjene er utilgjengelige for alle potensielle celletyper. Ved å isolere primære celler fra et bestemt område av interesse, spesielt fra en transgen mus, kan mer nyanserte studier utføres. Den grunnleggende teknikken innebærer dissekere organ eller delvis organ av interesse (f.eks hjerte eller en bestemt region av hjertet) og dissociating orgelet til enkeltceller. Disse cellene blir deretter inkubert med magnetiske perler er konjugert til et antistoff som gjenkjenner den celletype av interesse. Cellene av interesse kan deretter bli isolert ved bruk av en magnet, med en kort inkubasjon trypsin dissosiere cellene fra kulene. Disse isolerte celler kan deretter bli dyrket og analysert som ønsket. Denne teknikken ble opprinnelig utviklet for voksen mus organs men kan lett skaleres ned for bruk med embryonale organer, som demonstrert heri. Fordi vår interesse ligger i å utvikle koronar blodkar, ønsket vi å undersøke dette populasjon av celler under bestemte embryonale stadier. Således hadde den opprinnelige protokoll for å bli modifisert for å være kompatibel med den lille størrelsen på de embryonale ventrikler og lave potensial utbytte av endotelceller på disse utviklingsstadier. Utnytte denne nedskalert tilnærming, har vi vurdert koronar plexus ombygging i transgene embryonale ventrikulære endotelceller.
Introduction
Ankomsten av udødeliggjort cellelinjer har revolusjonert grunnleggende cellebiologi en. De for tiden tilgjengelige cellelinjer er avledet fra et bredt spekter av organer og omfatter alle de store celletyper. Imidlertid etablerte cellelinjer har noen begrensninger. Prosessen med immortalization tydeligvis endrer oppførselen av cellene, spesielt med hensyn til levetid og proliferasjon, men kan også påvirke ekspresjonen av uventede proteiner, slik som proteiner cytoskeletal 2. I tillegg, selv om mange forskjellige cellelinjer er tilgjengelige, er det vesentlig diversitet blant til og med en enkelt celle type innenfor en hel organisme. Endotelceller særlig vise ulike atferd basert på om de stiller arterier eller årer og hva slags flyt er til stede i fartøyet tre. Enda mer presserende fra et utviklingsperspektiv, er imidlertid at de aller fleste av de tilgjengelige cellelinjer er avledet fra voksent vev (se f.eks tHan samlingen tilgjengelig via ATCC). Disse voksne cellelinjer sannsynlig ikke rekapitulere de dynamiske egenskapene til sine embryonale forløpere. De raskt skiftende tid og rom genuttrykksmønster observert under utvikling tyder også på at en endotelceller fra ett organ på et gitt utviklingsstadiet ikke kan oppføre seg på samme måte som en endotelceller fra at samme organ på et annet utviklingstrinn.
Som et alternativ til å bruke kommersielt tilgjengelige immortaliserte cellelinjer, kan primære celler isoleres fra den spesifikke vev av interesse. Blant fordelene med denne teknikken, kan disse primære celler isoleres fra et bestemt organ eller en del av et organ til enhver spesifikk utviklingsstadiet. Videre kan disse primære celler isoleres fra et stort utvalg av tilgjengelige transgene dyr, slik at in vitro-undersøkelse av genet knockout og knock-in og unngå andre problemer som transfeksjon effektivitet. Ikke overraskende, mangeteknikker har blitt publisert informasjon om hvordan å isolere bestemte celletyper 4,5. Generelt involverer disse teknikker samle regionen av interesse, dissosiere cellene, merking den spesifikke celletype av interesse, og å isolere disse cellene for ytterligere analyse.
For å studere en tidlig embryonisk populasjon av koronare endoteliale celler, skalert vi ned en tidligere publisert teknikk 4, for bruk med en mindre organ. Med denne nedskalert prosedyre, kan vi isolere koronar endotelceller fra embryonale hjertet på bestemte embryonale stadier. Disse cellene kan deretter brukes i tradisjonelle endoteliale assays, for eksempel flytteanalyser. Inntil tidlig på embryonale cellelinjer blir mer utbredt, som arbeider med de primære celler er en uvurderlig teknikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbeide med primære embryonale celler gjør romanen eksperimenter for å ta in vitro kritiske trinn i utviklingen. Imidlertid er isoleringsprosedyre ikke trivielt. Kritiske trinn for å isolere en hvilken som helst type celler herunder at cellene er godt atskilt ved kollagenase fordøyelse og så at de er godt suspenderes i vasketrinnet. Mekanisk disseksjon ved pipettering bidrar sterkt skille cellene i løpet av collagenase trinnet, og filtrering trinnet fjerner klumper av celler. Denne fremgangsmåten forbed…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Andrea Portbury for kritisk lesing av manuskriptet, mikroskopet service Laboratorium for UNC for å få hjelp med time-lapse imaging, og NIH (tilskudd # R01HL061656) for finansiering støtte.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
- Landecker, H. . Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
