Biochemische Titratie van glycogeen<em> In vitro</em
Summary
We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische methode voor titratie van glycogeen in vitro. Deze techniek gebruikt de Abcam Glycogen testkit en is gebaseerd op opeenvolgende hydrolyse van glycogeen tot glucose en glucose titratie van fluorescentie.
Abstract
Glycogeen is de belangrijkste energetische polymeer van glucose in gewervelde dieren speelt een cruciale rol geheel stofwisseling en in cellulair metabolisme. Vele manieren om glycogeen te sporen bestaat, maar slechts een paar zijn kwantitatief. We beschrijven hier een methode waarbij de Abcam Glycogen testkit, die is gebaseerd op specifieke afbraak van glycogeen tot glucose met glucoamylase. Glucose wordt vervolgens geoxideerd tot een specifiek product dat reageert met de OxiRed probe fluorescentie te produceren. Titratie is nauwkeurig, gevoelig en kan worden bereikt op mobiele extracten of coupes. In tegenstelling tot andere technieken, zij geen informatie over de verdeling van glycogeen in de cel geven. Als voorbeeld van deze techniek, beschrijven we hier de titratie van glycogeen in twee cellijnen, Chinese hamster long fibroblasten CCL39 en humaan coloncarcinoom LS174, geïncubeerd in normoxia (21% O2) tegen hypoxie (1% O2). Onze hypothese was dat hypoxie is een signal die bereidt cellen synthetiseren en opslaan glycogeen om te overleven 1.
Introduction
Glycogeen is een multibranched polymeer van glucose residuen die aanwezig zijn in het cytoplasma van vele celtypen. Het is een van de belangrijkste vormen van energieopslag in cellen en speelt een belangrijke rol in glucosemetabolisme. De meeste zoogdiercellen kunnen opslaan en glycogeen, die snel kunnen worden afgebroken tot glucose om glycolyse en ATP productie te bevorderen tijdens metabole stress produceren. Hepatocyten produceren grote hoeveelheden glycogeen de bloedsuikerspiegel waardoor een continue aanvoer van glucose aan het lichaam. In tegenstelling, de concentratie van glycogeen in andere cellen (spieren, rode bloedcellen, etc.) relatief laag. Echter, plaatselijk, deze hoeveelheden voldoende om energie op korte termijn wanneer de cellen plotseling blootgesteld aan een omgeving beroofd van voedingsstoffen.
Glycogeen synthese en afbraak glycogeen volgt dezelfde stappen in alle weefsels (figuur 1). Allereerst glucosebinnenkomt cellen door glucose transporters (gluts) en snel omgezet van glucose-6-fosfaat (G6P) in glucose-1-fosfaat (G1P) van fosfoglucomutase. G1P wordt dan gewijzigd in UDP-glucose, en het koolstofatoom C1 UDP-glucose is een tyrosine residu glycogenin, de verankering eiwit van glycogeen gehecht. Dit molecuul, beschouwd als een glycogeen primer, wordt verlengd met bevestiging van de UDP-glucose naar de terminal glucose door een α (1 → 4) binding via de glycogeen synthase. Tenslotte, wanneer een lineaire keten van meer dan 11 glucose residuen gevormd, het vertakkingsenzym brengt een terminal oligosaccharide gevormd door ten minste 6 glucose residuen ander glucose van de keten nabijgelegen via een α (1 → 6) binding. De herhaling van dit proces geeft een enorme fractale structuur met takken die een helix met 6,5 glucose per beurt vormen. Glycogeen kan omgekeerd gehydrolyseerd worden tot glucose door de gezamenlijke actievan debranching enzymen die de α (1 → 6) gebonden en glycogeenfosforylase dat de α (1 → 4) glycosidische gebonden tussen de laatste resten van glucose van een tak en het glycogeen molecuul hydrolyseert hydrolyseren. Deze reactie heet glycogenolysis wordt geactiveerd door het verhogen van het niveau van AMP (reflecterende ATP consumptie), en geremd door glucose en ATP 2,3.
Door elektronenmicroscopie werden glycogeen moleculen zijn beschreven in vele celtypen als β vrije deeltjes (of glycogeen monoparticles) van 15-30 nm in diameter. In specifieke celtypen zoals hepatocyten, kan β deeltjes worden samengevoegd tot een complex rozetten, ook wel α deeltjes die variëren in diameter van 80 nm tot maximaal 200 nm 4 vormen </sup>. De manier waarop deze β deeltjes zijn samengevoegd tot grotere clusters van α-deeltjes te vormen is nog niet volledig opgehelderd. Enig bewijs lijkt aan te tonen dat β deeltjes worden gebonden door covalente binding 5, waterstofbinding, of zelfs door eiwit-eiwit interacties 6. De hoeveelheid glycogeen in de cellen is afhankelijk van vele parameters: (I) de hoeveelheid glycogenin in de cel die glycogeen synthese initieert, (II) de activiteit van glycogeen synthase en fosforylase gereguleerd door eiwit fosforylatie / defosforylatie, (III) hetzij van glucose in de cellen, die afhankelijk is van verschillende parameters zoals de aanvoer van glucose uit het vasculaire systeem en glucoseopname door cellen. Glycogeenopslag zijn strak gereguleerd door allosterische regulering van biosynthetische hormonen via intermediaire metabolieten, door hormonen reguleren energiemetabolisme, en door nutrient sensing signaalwegen 7.
Het is belangrijk omkunnen glycogeen kwantificeren in biologische monsters beter te begrijpen van het belang van glycogeen metabolisme in het gehele lichaam en cellulaire niveau. We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische in vitro test voor glycogeen. Deze techniek is gebaseerd op het kwantificeren glucose fluorescentie voor en na specifieke hydrolyse van glycogeen.
Andere methoden bestaan om het niveau van glycogeen schatten in de cellen, maar de meeste zijn niet kwantitatief. Een van de eerste technieken beschreven voor het kwantificeren van glycogeen in de cellen was gebaseerd op metingen van [14C]-glucose opname in glycogeen 8,9. Het gebruik van radioactiviteit maakt dit proces moeilijker te hanteren, maar het heeft het voordeel dat de snelheid van glucose opname in glycogeen en onderscheiden tussen de verdeling van glucose residuen op de buitenste takken en in de kern van het molecuul (het vereist ook een Aanvullende β-amylolysis en een chromatografische stap). Een andere techniek is meer recent ontwikkeld en is gebaseerd op de opname van 2-NBDG (2 – {N-[,3-diazol 4-yl-7-nitrobenz-2-oxa-1] amino}-2-deoxyglucose), een 2-deoxyglucose fluorescerend derivaat, in glycogeen 10. De gemeten fluorescentie-intensiteit geeft de hoeveelheid glycogeen geproduceerd en kan worden gemeten met een fluorescentie lezer. Verdeling van fluorescentie in de cel kan ook worden geëvalueerd door confocale microscopie.
Onder de andere nonquantitative technieken, Periodic Acid-Schiff kleuring (PAS) is misschien wel de meest voorkomende. Het kan gebruikt worden voor de detectie van glycogeen in gefixeerde cellen, weefselcoupes in paraffine of bevroren. Deze histologische techniek kleuren niet specifiek polysacchariden, glycolipiden, glycoproteïnen, cellulose en neutrale mucines in paars. De specificiteit van deze test kan worden verhoogd door behandeling van gefixeerde cellen of weefselsecties met diastase, die specifiek verteert glycogeen. Daarnahet niveau van glycogeen kan kwalitatief worden geschat door het vergelijken van gehydrolyseerde monsters (alle koolhydraten gemodificeerde macromoleculen) om gehydrolyseerde monsters (koolhydraten gemodificeerde macromoleculen behalve glycogeen). PAS kleuring en microscopische analyse tegenstelling biochemische analyses van glycogeen, geeft informatie over de verdeling van glycogeen in de cellen, die kunnen worden verspreid of geconcentreerd in een bepaald deel van de cel. Echter, hoewel PAS kleuring schattingen verschillen glycogeen verschillende omstandigheden is niet kwantitatief 11.
Een monoklonaal muizenantilichaam oorspronkelijk gebruikt mandibulaire condylaire kraakbeen antigeen waargenomen tussen glycogeen in cellen en gezuiverd glycogeen reageren in vitro 12. Aangezien dit antilichaam herkent specifiek glycogeen gerelateerde suikerketens is een nuttig hulpmiddel voor de detectie van glycogeen door immunohistochemie op een meer specifieke wijze dan de PAS kleuring. </p>
Elektronenmicroscopie is een andere techniek die visualisatie van korrels van glycogeen in de cellen en de evaluatie van de mate van glycogeen opslag mogelijk maakt. In feite, glycogeen β deeltjes herkenbaar met een elektron microscopie elektron granulen 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biochemische titratie van glycogeen in vitro maakt een nauwkeurige kwantificering van cellen glycogeengehalte. In vergelijking met een aantal andere technieken (PAS, immunofluorescentie met een glycogeen antilichaam, enz.), Deze titratie is zeer specifiek, gevoelig en reproduceerbaar. Bovendien is de werkwijze is gunstig omdat het geen radioactiviteit maar een fluorescentie spectrometer vereist. Deze techniek is zuiver kwantitatieve en ofwel informaties glycogeen verspreiding in de cel kan worden gebra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar voor de Dr Thierry POURCHER voor zodat we de fluorescentie spectrometer gebruiken en voor zijn hulp. Het laboratorium wordt gefinancierd door de Ligue Nationale Contre le Cancer (equipe Labellisee), de Vereniging pour la Recherche contre le Cancer, het Institut National du Cancer (INCA), de Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU-programma KP7), het Centrum A. Lacassagne, het Centre National de la Recherche Scientifique, het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale en de Universiteit van Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Wij danken dr. M Christiane Brahimi-Hoorn voor het kritisch lezen en redactionele correctie.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. “Fluorescent glycogen” formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
