Se describe aquí un método bioquímico exacta, reproducible y conveniente para la titulación de glucógeno in vitro. Esta técnica utiliza el kit de ensayo de Abcam glucógeno y se basa en la hidrólisis sucesivas de glucógeno en glucosa y la glucosa titulación por fluorescencia.
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Artículo de método
Titulación bioquímica de glucógeno
En este artículo
Resumen
Resumen
El glucógeno es la principal de polímero energético de la glucosa en animales vertebrados y juega un papel crucial en el metabolismo de todo el cuerpo, así como en el metabolismo celular. Ya existen muchos métodos para detectar glucógeno pero sólo unos pocos son cuantitativos. Se describe aquí un método que utiliza el kit de ensayo de Abcam glucógeno, que se basa en la degradación específica de glucógeno en glucosa por glucoamilasa. La glucosa se oxida específicamente a un producto que reacciona con la sonda OxiRed para producir fluorescencia. La titulación es preciso, sensible y se puede lograr en extractos de células o secciones de tejido. Sin embargo, en contraste con otras técnicas, no da información sobre la distribución de glucógeno en la célula. Como ejemplo de esta técnica, como se describe aquí la titulación de glucógeno en dos líneas celulares, chino CCL39 fibroblastos de pulmón de hámster y LS174 carcinoma de colon humano, se incubaron en normoxia (21% de O 2) frente a la hipoxia (1% de O 2). La hipótesis de que la hipoxia es un signal que prepara las células para sintetizar y almacenar glucógeno para sobrevivir 1.
Introducción
El glucógeno es un polímero multibranched de residuos de glucosa, que está presente en el citoplasma de muchos tipos de células. Es una de las principales formas de almacenamiento de energía en las células y juega un papel importante en el metabolismo de la glucosa. La mayoría de las células de mamífero son capaces de producir y glucógeno tienda, que puede ser degradado rápidamente en glucosa para promover la glicolisis y la producción de ATP durante el estrés metabólico. Los hepatocitos producen cantidades masivas de glucógeno para regular el nivel de azúcar en la sangre proporcionando con ello un suministro continuo de glucosa para el cuerpo. En contraste, la conce....
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Protocolo
Titulación bioquímica de glucógeno
1. La lisis celular
- Se siembran las células a una concentración de 0,5 a 2 x 10 6 por placa de 100 mm de diámetro.
- Tratamiento: incubar las células 24, 48, o 72 horas en baja concentración de oxígeno (hipoxia) en una estación de trabajo anaeróbico Bug-Box (Ruskinn Tecnología Biotrace International Plc, Bridgend, Reino Unido), fijado en el 1% o el 0,1% de O 2, 94% o 94,9% de N 2, y 5% de CO 2. En paralelo, se incuban las células en normoxia (21% de O 2, 5% de CO 2). Cambio de medio (medio que contiene glucosa-25 mM) cada ....
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Resultados
Un nivel bajo de oxígeno (hipoxia) en señales de tumores a las células tumorales la necesidad de almacenar energía para manejar agotamiento de los nutrientes posterior, a fin de sobrevivir. Como glucógeno es la principal polímero energético de la glucosa en las células de mamíferos, se estudió la regulación del almacenamiento de glucógeno en la hipoxia. El cálculo y la normalización de la concentración de glucógeno en los lisados celulares se deben realizar en los datos en bruto de la fluorescencia como se muestra en .......
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Discusión
Valoración bioquímica de la glucógeno in vitro permite una cuantificación precisa de las células el contenido de glucógeno. En comparación con algunas otras técnicas (PAS, de inmunofluorescencia con un anticuerpo glucógeno, etc.), Esta valoración es muy específico, sensible y reproducible. Por otra parte, el método es conveniente ya que no requiere la radiactividad pero un espectrómetro de fluorescencia. Sin embargo, esta técnica es puramente cuantitativa y no proporciona información sobre la distribuc.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos con el Dr. Thierry Pourcher para permitirnos usar el espectrómetro de fluorescencia y por su ayuda. El laboratorio está financiado por la Ligue Nationale Contre le Cancer (labellisée équipe), la Association pour la Recherche contre le Cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer du (INCA), la Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programa de la UE FP7), el Centro A. Lacassagne, el Centre National de la Recherche Scientifique, el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale y la Universidad de Niza ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Damos las gracias a la Dra. M Christiane Br....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| REACTIVOS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Kit de ensayo de glucógeno | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrómetro | PerkinElmer | LS 50B |
Referencias
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J<....
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Reimpresiones y permisos
