Titolazione biochimica di glicogeno<em> In vitro</em
Summary
Descriviamo qui un metodo biochimico accurato, riproducibile e conveniente per la titolazione del glicogeno in vitro. Questa tecnica utilizza il kit di analisi Abcam glicogeno e si basa sulla successiva idrolisi del glicogeno in glucosio e titolazione mediante fluorescenza.
Abstract
Il glicogeno è la principale polimero energetico del glucosio negli animali vertebrati e svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo del corpo intero e nel metabolismo cellulare. Esistono già molti metodi per rilevare glicogeno, ma solo pochi sono di tipo quantitativo. Descriviamo qui un metodo che utilizza il kit di analisi Abcam Glicogeno, che si basa sulla specifica degradazione del glicogeno in glucosio da glucoamilasi. Il glucosio viene ossidato specificamente ad un prodotto che reagisce con la sonda OxiRed per produrre fluorescenza. La titolazione è preciso, sensibile e può essere realizzato su estratti cellulari o sezioni di tessuto. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, non dà informazioni sulla distribuzione del glicogeno nella cellula. Come esempio di questa tecnica, descriviamo qui la titolazione di glicogeno in due linee cellulari, cinese CCL39 fibroblasti di polmone di criceto e LS174 carcinoma del colon umano, incubati in normossia (21% O 2) rispetto ipossia (1% O 2). Abbiamo ipotizzato che l'ipossia è un segnalenale che prepara le cellule per sintetizzare e conservare glicogeno per sopravvivere 1.
Introduction
Il glicogeno è un polimero con molti rami di residui di glucosio, che è presente nel citoplasma di molti tipi di cellule. È una delle principali forme di immagazzinamento dell'energia nelle cellule e svolge un ruolo importante nel metabolismo del glucosio. La maggior parte delle cellule di mammiferi sono capaci di produrre e immagazzinare glicogeno, che può essere rapidamente degradato in glucosio per promuovere la glicolisi e produzione di ATP durante lo stress metabolico. Gli epatociti producono enormi quantità di glicogeno per regolare il livello di zucchero nel sangue fornendo così un approvvigionamento continuo di glucosio nel corpo. Al contrario, la concentrazione di glicogeno in altre cellule (muscoli, globuli rossi, ecc) è relativamente bassa. Tuttavia, localmente, queste quantità sono sufficienti a fornire energia a breve termine, quando le cellule sono improvvisamente esposti a un ambiente privo di sostanze nutritive.
Sintesi di glicogeno e la ripartizione del glicogeno segue gli stessi passi in tutti i tessuti (Figura 1). In primo luogo, il glucosioentra cellule trasportatori del glucosio (glutei), e viene rapidamente convertito dal glucosio-6-fosfato (G6P) in glucosio-1-fosfato (G1P) da fosfoglucomutasi. G1P viene quindi modificato in UDP-glucosio e il carbonio C1 di UDP-glucosio è attaccato ad un residuo di tirosina glycogenin, la proteina di ancoraggio di glicogeno. Questa molecola, considerato un primer glicogeno, viene esteso mediante attacco del UDP-glucosio al glucosio terminale da un α (1 → 4) bond tramite il glicogeno sintasi. Infine, quando si forma una catena lineare di oltre 11 residui di glucosio, l'enzima di ramificazione trasferisce un oligosaccaride terminale costituito da un minimo di 6 residui di glucosio all'altro glucosio della catena vicina attraverso un α (1 → 6) linkage. La ripetizione di questo processo dà una struttura frattale massiccia contenente rami che formano un'elica con 6,5 glucosio ogni turno. Il glicogeno può essere inversamente idrolizzato al glucosio con l'azione concertatadebranching di enzimi che idrolizzano il α (1 → 6) vincolato e glicogeno fosforilasi che idrolizza il α (1 → 4) glicosidico limite tra l'ultimo residuo di glucosio di un ramo e la molecola di glicogeno. Questa reazione chiamato glicogenolisi viene attivato aumentando i livelli di AMP (riflettente consumo di ATP), e inibito dal glucosio e ATP 2,3.
Mediante microscopia elettronica, le molecole di glicogeno sono stati descritti in molti tipi cellulari particelle β libere (o monoparticelle glicogeno) di 15-30 nm di diametro. In specifici tipi cellulari quali epatociti, particelle β possono essere assemblate in un complesso per formare rosette, noto anche come particelle α che variano in diametro da 80 nm a un massimo di 200 nm 4 </sup>. Il modo in cui queste particelle β sono legati per formare grandi aggregati di particelle α non è ancora completamente chiarito. Alcune prove tende a dimostrare che le particelle β possono essere legati da legami covalenti 5, legame a idrogeno, o anche attraverso le interazioni proteina-proteina 6. La quantità di glicogeno immagazzinato nelle cellule dipende da molti parametri: (I) la quantità di glycogenin nella cella che inizia la sintesi del glicogeno, (ii) l'attività di glicogeno sintasi e fosforilasi regolato dalla proteina fosforilazione / defosforilazione; (III) la concentrazione di glucosio nelle cellule, che dipende da diversi parametri, quali la fornitura di glucosio dal sistema vascolare e l'assorbimento del glucosio da parte delle cellule. Le riserve di glicogeno sono strettamente regolati da regolazione allosterica di ormoni biosintetici attraverso metaboliti intermedi, da ormoni che regolano il metabolismo energetico, e attraverso vie di segnalazione di rilevamento nutrienti 7.
È importante esseregrado di quantificare glicogeno in campioni biologici per meglio comprendere l'importanza del metabolismo del glicogeno in tutto il corpo e livello cellulare. Descriviamo qui un preciso, riproducibile e conveniente biochimico prova in vitro per glicogeno. Questa tecnica si basa sulla fluorescenza quantificazione glucosio prima e dopo specifico idrolisi di glicogeno.
Altri metodi esistono per stimare il livello di glicogeno nelle cellule, ma la maggior parte di essi non sono quantitative. Una delle prime tecniche descritte per la quantificazione di glicogeno nelle cellule era basato sulla misurazione di costituzione [14 C]-glucosio in glicogeno 8,9. L'uso di radioattività rende questo processo più difficile da gestire, ma ha il vantaggio di fornire la velocità di incorporazione del glucosio in glicogeno e nel distinguere tra la distribuzione di residui di glucosio sui rami esterni e nel nucleo della molecola (richiede anche un ulteriori β-amylolysis ed una fase cromatografica). Un'altra tecnica è stata sviluppata più recentemente e si basa sull'incorporazione di 2-NBDG (2 – {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-il] ammino}-2-deossiglucosio), un derivato fluorescente 2-deossiglucosio, in glicogeno 10. L'intensità di fluorescenza misurata riflette la quantità di glicogeno prodotta e può essere misurata con un lettore di fluorescenza. Distribuzione di fluorescenza nella cella può essere valutata mediante microscopia confocale.
Tra le altre tecniche nonquantitative, Periodic Acid Schiff colorazione (PAS) è forse il più comune. Può essere usato per la rilevazione di glicogeno in cellule fissate, sezioni di tessuto in paraffina o congelati. Questo istologici colori tecnica non specificamente polisaccaridi, glicolipidi, glicoproteine, cellulosa e mucine neutre in viola. La specificità di questo test può essere aumentata mediante trattamento di cellule fissate o sezioni di tessuto con diastasi, che digerisce specificamente glicogeno. Successivamente,il livello di glicogeno può essere qualitativamente stimata confrontando campioni non idrolizzati (tutti macromolecole carboidrati modificati) per campioni idrolizzati (carboidrati modificato macromolecole tranne glicogeno). Colorazione PAS e analisi microscopica, a differenza saggi biochimici di glicogeno, fornisce informazioni relative alla distribuzione di glicogeno nella cellula, che può essere diffusa o concentrata in una determinata parte della cellula. Tuttavia, anche se le differenze stime PAS colorazione in accumulo glicogeno tra condizioni diverse, non è quantitativa 11.
Un anticorpo monoclonale di topo originariamente realizzato utilizzando condilare mandibolare cartilagine come antigene ha dimostrato di reagire con glicogeno in cellule e con glicogeno purificato in vitro 12. Dato che questo anticorpo riconosce specificamente catene di zuccheri glicogeno riscontrato, è un utile strumento per la rilevazione di glicogeno mediante immunoistochimica in maniera più specifica della colorazione PAS. </p>
La microscopia elettronica è un'altra tecnica che permette la visualizzazione di grani di glicogeno nelle cellule e la valutazione del grado di glicogeno accumulo. Infatti, le particelle β glicogeno sono facilmente riconoscibili con un microscopio elettronico come elettroni densi granuli 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Titolazione biochimica di glicogeno in vitro permette una quantificazione precisa delle cellule contenuto di glicogeno. Rispetto ad altre tecniche (PAS, immunofluorescenza con un anticorpo glicogeno, ecc.), Questa titolazione è molto specifico, sensibile e riproducibile. Inoltre, il metodo è conveniente in quanto richiede nessuna radioattività ma uno spettrometro a fluorescenza. Tuttavia, questa tecnica è puramente quantitativa e non fornisce informazioni sulla distribuzione glicogeno nella cella. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al Dr. Thierry Pourcher per averci permesso di utilizzare lo spettrometro a fluorescenza e per il suo aiuto. Il laboratorio è finanziato dalla Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), l'Associazione pour la Recherche contre le Cancer, l'Institut National du Cancer (INCA), l'Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programma dell'UE 7 ° PQ), il Centro A. Lacassagne, il Centre National de la Recherche Scientifique, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale e l'Università di Nizza ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Ringraziamo il Dott. M Christiane Brahimi-Horn per la lettura critica e la correzione editoriale.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
References
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