Biokemiska Titrering av glykogen<em> In vitro</em
Summary
Vi beskriver här en noggrann, reproducerbar och praktiskt biokemisk metod för titrering av glykogen in vitro. Denna teknik använder Abcam Glykogen analyssats och är baserad på på varandra följande hydrolys av glykogen till glukos och glukos-titrering genom fluorescens.
Abstract
Glykogen är den huvudsakliga energisk polymer av glukos i ryggradsdjur och spelar en avgörande roll för hela kroppen metabolism och i cellulär metabolism. Många metoder för att upptäcka glykogen finns redan, men bara ett fåtal är kvantitativ. Vi beskriver här en metod som använder den Abcam Glykogen analyssats, som är baserad på specifik nedbrytning av glykogen till glukos med glukoamylas. Glukos sedan specifikt oxideras till en produkt som reagerar med OxiRed sonden för att producera fluorescens. Titrering är korrekt, känsligt och kan uppnås på cellextrakt eller vävnadssektioner. Emellertid i motsats till andra tekniker, att det inte ger information om fördelningen av glykogen i cellen. Som ett exempel på denna teknik, beskriver vi här titreringen av glykogen i två cellinjer, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 och humant kolonkarcinom LS174, inkuberade i normoxia (21% O2) i jämförelse med hypoxi (1% O2). Vi antog att hypoxi är en betynal som förbereder celler för att syntetisera och lagra glykogen för att överleva en.
Introduction
Glykogen är en flergrenad polymer av glukosrester, som är närvarande i cytoplasman hos många celltyper. Det är en av de viktigaste formerna av energilagring i celler och spelar en viktig roll i glukosmetabolismen. De flesta däggdjursceller kan producera och lagra glykogen, som snabbt kan brytas ned till glukos för att främja glykolys och ATP-produktion under metabolisk stress. Leverceller producerar enorma mängder av glykogen för att reglera blodsockernivån vilket ger en kontinuerlig tillförsel av glukos i kroppen. I motsats härtill är koncentrationen av glykogen i andra celler (muskler, röda blodkroppar, etc.) relativt lågt. Men lokalt, dessa mängder är tillräckliga för att ge energi på kort sikt när cellerna plötsligt exponeras för en omgivning berövas näringsämnen.
Glykogensyntes och glykogen nedbrytning följer samma steg i alla vävnader (Figur 1). För det första, glukosträder cellerna genom glukostransportörer (gluts), och omvandlas snabbt från glukos-6-fosfat (G6P) till glukos-1-fosfat (G1P) genom fosfoglukomutas. G1P modifieras sedan till UDP-glukos, och kolet C1 av UDP-glukos är bunden till en tyrosinrest i glykogeninet, den förankrande proteinet av glykogen. Denna molekyl, anses vara en glykogen primer förlängs genom fastsättning av UDP-glukos till den terminala glukos av en α (1 → 4)-bindning via glykogensyntas. Slutligen, när en linjär kedja med över 11 glukosenheter bildas, överför det förgrenande enzymet en terminal oligosackarid bestående av minst sex glukosrester till en annan glukos av kedjan i närheten genom en α (1 → 6)-bindning. En upprepning av denna process ger en massiv fraktal struktur med grenar som bildar en spiral med 6,5 glukos per varv. Glykogen kan vara omvänt hydrolyseras till glukos genom samordnade åtgärderav avgrenande enzymer som hydrolyserar den α (1 → 6) bundet och glykogenfosforylas som hydrolyserar α (1 → 4) glykosidiska bunden mellan den sista resten av glukos av en gren och glykogenmolekyl. Denna reaktion kallas glykogenolys aktiveras genom att öka nivåerna av AMP (reflekterande ATP-förbrukning), och hämmas av glukos och ATP 2,3.
Genom elektronmikroskopi har glykogenmolekyler har beskrivits i många celltyper som β fria partiklar (eller glykogen monoparticles) av 15 till 30 nm i diameter. I specifika celltyper såsom hepatocyter, kan β partiklar sättas samman till en komplex bildar rosetter, även känd som α-partiklar som varierar i diameter från 80 nm till högst 200 nm 4 </sup>. Hur dessa β partiklar är bundna till större kluster av α-partiklar är fortfarande inte helt klarlagd. Vissa bevis tenderar att bevisa att β-partiklar kan bindas genom kovalent bindning 5, vätebindning, eller ens genom protein-proteininteraktioner 6. Mängden glykogen som lagras i cellerna beror på många parametrar: (I) mängden glykogeninet i cellen som initierar glykogensyntes, (II) aktiviteten av glykogensyntas och fosforylas regleras av proteinfosforylering / defosforylering, (III) koncentrationen av glukos i cellerna, vilket är beroende av flera parametrar, såsom tillförseln av glukos från det vaskulära systemet och glukosupptag genom celler. Glykogen butiker är hårt reglerad av allosterisk reglering av biosyntetiska hormoner genom mellanliggande metaboliter, av hormoner som reglerar ämnesomsättningen, och genom näringssensorsignalvägar 7.
Det är viktigt att varakunna kvantifiera glykogen i biologiska prover för att bättre förstå vikten av glykogenmetabolism i hela kroppen och cellnivå. Vi beskriver här en noggrann, reproducerbar och praktiskt biokemiska i analys vitro för glykogen. Denna teknik är baserad på kvantifiering av glukos fluorescens före och efter specifik hydrolys av glykogen.
Andra metoder finns för att uppskatta nivån av glykogen i cellerna, men de flesta av dem är inte kvantitativ. En av de första teknikerna som beskrivs för kvantifiering av glykogen i cellerna baserades på mätning av [14 C]-glukos inkorporering i glykogen 8,9. Användningen av radioaktivitet gör denna process det svårare att hantera, men det har den fördelen att den ger hastigheten av glukos införlivande i glykogen och för att skilja mellan fördelningen av glukosrester på de yttre grenarna och i kärnan av molekylen (det kräver också en ytterligare β-amylolysis och kromatografiska steg). En annan teknik har utvecklats på senare tid och är baserad på inkorporeringen av två-NBDG (2 – {N-[7-nitrobens-2-oxa-1 ,3-diazol-4-yl] amino}-2-deoxiglukos), ett 2-deoxiglukos fluorescerande derivatet, till glykogen 10. Den uppmätta fluorescensintensiteten återspeglar mängden glykogen som tillverkas och kan mätas med en fluorescensläsare. Fördelning av fluorescens i cellen kan också utvärderas genom konfokalmikroskopi.
Bland de andra nonquantitative teknik är perjodsyra-Schiff-färgning (PAS) kanske den vanligaste. Den kan användas för detektionen av glykogen i fixerade celler, vävnadssnitt i paraffin eller frusen. Denna histologiska färger teknik som inte specifikt polysackarider, glykolipider, glykoproteiner, cellulosa och neutrala muciner i lila. Specificiteten för detta test kan ökas genom behandling av fixerade celler eller vävnadssektioner med diastas, som specifikt digererar glykogen. Däreftergraden av glykogen kan kvalitativt uppskattas genom att jämföra ohydrolyserade prover (alla kolhydrater modifierade makromolekyler) till hydrolyserade prover (kolhydrat modifierade makromolekyler utom glykogen). PAS-färgning och mikroskopisk analys, till skillnad från biokemiska analyser av glykogen ger upplysningar om fördelningen av glykogen i cellen, vilka kan diffundera eller koncentreras i en viss del av cellen. Men även om PAS-färgning uppskattningar skillnader i glykogen ackumulation mellan olika förhållanden, är det inte kvantitativ 11.
En monoklonal musantikropp som ursprungligen gjordes med användning mandibular kondylära brosk som antigenet har visat sig reagera med glykogen i cellerna och med renat glykogen in vitro 12. Eftersom denna antikropp specifikt känner igen glykogenrelaterade sockerkedjor, är det ett användbart verktyg för detektion av glykogen genom immunhistokemi på ett mer specifikt sätt än PAS-färgning. </p>
Elektronmikroskopi är en annan teknik som tillåter visualisering av korn av glykogen i celler och utvärdering av graden av glykogenlagring. Faktum glykogen β partiklar är lätt att känna igen med ett elektronmikroskop som elektrontäta granulat 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biokemiska titrering av glykogen in vitro ger en exakt kvantifiering av celler glykogeninnehåll. Jämfört med vissa andra tekniker (PAS, immunofluorescens med en glykogen antikropp, osv.), Är denna titrering väldigt specifika, känslig och reproducerbar. Dessutom är metoden bekvämare, eftersom den inte kräver någon radioaktivitet men en fluorescensspektrometer. Dock är denna teknik rent kvantitativ och ger ingen information om glykogen fördelning i cellen.
Den tek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för Dr Thierry Pourcher för att tillåta oss att använda fluorescens spektrometer och för hans hjälp. Laboratoriet finansieras av Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), Association pour la Recherche contre le Cancer, Institut National du Cancer (INCA), Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU-programmet FP7), Centrum A. Lacassagne, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale och universitetet i Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Vi tackar Dr M Christiane Brahimi-Horn för kritisk läsning och redaktionell korrigering.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. “Fluorescent glycogen” formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
