Biokemisk Titrering af glykogen<em> In vitro</em
Summary
Vi beskriver her en præcis, reproducerbar og bekvem biokemisk metode til titrering af glykogen in vitro. Denne teknik bruger Abcam glykogen assaykittet og er baseret på successiv hydrolyse af glykogen til glukose og glukose titrering med fluorescens.
Abstract
Glycogen er den vigtigste energisk polymer af glucose i hvirveldyr og spiller en afgørende rolle i hele kroppen stofskifte samt i cellulær metabolisme. Der findes mange metoder til påvisning glykogen allerede, men kun få er kvantitativ. Vi beskriver her en fremgangsmåde, ved hjælp af Abcam glykogen assay kit, som er baseret på specifikke nedbrydning af glycogen til glucose med glucoamylase. Glucose derefter specifikt oxideres til et produkt, der reagerer med OxiRed proben til at producere fluorescens. Titrering er præcis, følsom og kan opnås på celleekstrakter eller vævssnit. Men i modsætning til andre teknikker, er det ikke at give information om fordelingen af glykogen i cellen. Som et eksempel på denne teknik, vi beskriver her titrering af glykogen i to cellelinier, kinesisk hamster lungefibroblast CCL39 og human coloncarcinom LS174, inkuberet i normoxi (21% O 2) versus hypoxi (1% O 2). Vi antager, at hypoxi er en væsentnal, der forbereder celler til at syntetisere og lagre glycogen for at overleve 1.
Introduction
Glycogen er et multibranched polymer af glucoserester der er til stede i cytoplasmaet i mange celletyper. Det er en af de vigtigste former for energilagring i celler og spiller en vigtig rolle i glukosemetabolismen. De fleste pattedyrceller er i stand til at producere og opbevare glykogen, som kan nedbrydes hurtigt til glukose for at fremme glykolyse og ATP produktion i metabolisk stress. Hepatocytter producerer enorme mængder af glycogen til at regulere blodsukker, hvorved der tilvejebringes en kontinuerlig forsyning af glucose til kroppen. I modsætning hertil er koncentrationen af glykogen i andre celler (muskler, røde blodlegemer, osv.) er forholdsvis lav. Men lokalt, disse mængder er tilstrækkelige til at give energi på kort sigt, når cellerne pludselig udsættes for et miljø frataget næringsstoffer.
Glycogensyntese og glycogennedbrydning følger de samme trin i alle væv (figur 1). For det første, glucosetrænger ind i celler ved glukosetransportører (gluts), og hurtigt omdannes fra glucose-6-phosphat (G6P) til glucose-1-phosphat (G1P) ved phosphoglucomutase. G1P modificeres derefter i UDP-glucose og carbon C1 UDP-glucose er bundet til en tyrosinrest af glycogenin, forankring proteinet af glykogen. Dette molekyle, som en glycogen primer forlænges ved fastgørelse af UDP-glucose til terminalen glucose af en α (1 → 4)-binding via glycogensyntase. Endelig skal en lineær kæde af over 11 glucoserester er dannet, forgreningsenzymet overfører en terminal oligosaccharid udgøres af mindst 6 glucoserester anden glucose af kæden i nærheden via en α (1 → 6)-binding. Gentagelsen af denne proces giver en massiv fraktal struktur, der indeholder grene, der danner en spiral med 6,5 glucose pr tur. Glykogen kan være omvendt hydrolyseres til glucose af den samordnede aktionaf afgrening enzymer, der hydrolyserer den α (1 → 6) bundne og glycogenphosphorylase der hydrolyserer α (1 → 4)-glycosidisk bundet mellem den sidste rest af glucose af en filial og glykogen molekyle. Denne reaktion kaldes glycogenolyse aktiveres ved at øge niveauet af AMP (afspejler ATP forbrug) og hæmmes af glucose og ATP 2,3.
Ved elektronmikroskopi har glycogen-molekyler blevet beskrevet i mange celletyper β frie partikler (eller glykogen monopartikler) på 15-30 nm i diameter. I særlige celletyper såsom hepatocytter, kan β partikler samlet til et sammensat til at danne rosetter, også kendt som α-partikler, der varierer i diameter fra 80 nm til et maksimum på 200 nm 4 </sup>. Den måde, disse β partikler er bundet til dannelse af større klynger af α partikler endnu ikke er fuldt belyst. Nogle forhold synes at bevise, at β partikler kan bindes ved kovalent binding 5, hydrogenbinding, eller selv gennem protein-protein interaktioner 6. Mængden af glykogen lagret i cellerne afhænger af mange parametre: (I) mængden af glycogenin i den celle, der initierer glykogen syntese (II) aktivitet glykogensyntase og phosphorylase reguleret af proteinphosphorylering / defosforylering, (III) koncentrationen af glucose i cellerne, hvilket er afhængig af flere parametre, såsom levering af glucose fra det vaskulære system og glukoseoptagelse af celler. Glykogen butikker er stramt reguleret af allosterisk regulering af biosyntetiske hormoner gennem mellemliggende metabolitter, af hormoner, der regulerer stofskiftet, og ved næringsstoffer sensing signalveje 7.
Det er vigtigt at værestand til at kvantificere glykogen i biologiske prøver til bedre at forstå vigtigheden af glycogenmetabolisme på hele kroppen og celleniveau. Vi beskriver her en præcis, reproducerbar og bekvem biokemisk in vitro assay for glykogen. Denne teknik er baseret på kvantificering glucosefluorescens før og efter specifikke hydrolyse af glykogen.
Der findes andre metoder til at anslå størrelsen af glykogen i cellerne, men de fleste af dem er ikke kvantitativ. En af de første teknikker beskrevet til kvantificering af glykogen i celler baseret på måling af [14 C]-glucose inkorporering i glycogen 8,9. Anvendelsen af radioaktivitet gør denne proces mere vanskeligt at håndtere, men det har den fordel, at hastigheden af glucose inkorporering i glycogen, og at skelne mellem fordelingen af glucoserester på de ydre grene og i kernen af molekylet (det kræver også en yderligere β-amylolysis og et kromatografisk trin). En anden teknik blev udviklet for mere nylig og er baseret på inkorporering af 2-NBDG (2 – {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-yl] amino}-2-deoxyglucose), en 2-deoxyglucose fluorescerende derivat i glycogen 10. Den målte fluorescensintensitet afspejler mængden af glycogen, der produceres og kan måles med et fluorescens-læser. Fordeling af fluorescens i cellen kan også evalueres ved konfokal mikroskopi.
Blandt de øvrige nonquantitative teknikker, Periodic Acid-Schiff-farvning (PAS) er måske den mest almindelige. Det kan bruges til påvisning af glykogen i fikserede celler, vævssnit i paraffin eller frosset. Denne histologiske teknik farver ikke specifikt polysaccharider, glycolipider glycoproteiner, cellulose og neutrale muciner i lilla. Specificiteten af denne test kan øges ved behandling af faste celler eller vævssnit med diastase, der specifikt fordøjer glykogen. Derefterniveauet af glykogen kvalitativt kan skønnes ved at sammenligne ikke-hydrolyserede prøver (alle kulhydrat modificerede makromolekyler) for at hydrolyserede prøver (kulhydrat modificerede makromolekyler undtagen glykogen). PAS farvning og mikroskopisk analyse, i modsætning til biokemiske analyser af glykogen, giver oplysninger om fordelingen af glykogen i cellen, hvilket kan diffust eller koncentreret i en bestemt del af cellen. , Selvom PAS farvnings skøn forskelle i glycogenakkumulering mellem forskellige betingelser, er det imidlertid ikke kvantitativ 11.
Et monoklonalt muse-antistof oprindeligt fremstillet ved anvendelse af mandibular kondylær brusk som antigenet har vist sig at reagere med glycogen i celler og oprenset glycogen in vitro 12. Da dette antistof specifikt genkender glykogen-relaterede sukker kæder, det er et nyttigt redskab til påvisning af glykogen ved immunhistokemi på en mere specifik måde end PAS farvning. </p>
Elektronmikroskopi er en anden teknik, der tillader visualisering af korn af glykogen i celler og vurdering af graden af glycogen storage. Faktisk glykogen β-partikler er let genkendelige med en elektronmikroskopi som elektrondonorer tætte granulat 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biokemisk titrering af glykogen in vitro muliggør en nøjagtig kvantificering af celler glycogenindhold. Sammenligning til nogle andre teknikker (PAS, immunfluorescens med en glykogen antistof osv.), Denne titrering er meget specifik, følsom og reproducerbar. Desuden er fremgangsmåden praktisk, da det kræver ingen radioaktivitet, men en fluorescensspektrometer. Men denne teknik er rent kvantitativ og giver ikke oplysninger om glykogen distribution i cellen.
Teknikken er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Dr. Thierry Pourcher for at lade os bruge fluorescensspektrometer og for hans hjælp. Laboratoriet er finansieret af Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), Sammenslutningen pour la Recherche contre le Cancer, Institut National du Cancer (INCA), Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU-program FP7), Center A. Lacassagne, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale og University of Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Vi takker Dr. M Christiane Brahimi-Horn til kritisk læsning og redaktionel rettelse.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. “Fluorescent glycogen” formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
