Biokjemisk Titrering av Glykogen<em> In vitro</em
Summary
Vi beskriver her en nøyaktig, reproduserbar og praktisk biokjemisk metode for titrering av glykogen in vitro. Denne teknikken benytter Abcam Glykogen assay kit, og er basert på etterfølgende hydrolyse av glykogen til glukose og glukose titrering av fluorescens.
Abstract
Glykogen er hoved energisk polymer av glukose i virveldyr og spiller en avgjørende rolle i hele kroppens metabolisme, så vel som i cellulær metabolisme. Mange metoder for å oppdage glykogen allerede eksisterer, men bare et fåtall er kvantitativ. Vi beskriver her en metode ved hjelp av Abcam Glykogen analysen kit, som er basert på spesifikke degradering av glykogen til glukose ved glucoamylase. Glukose er da spesielt oksydert til et produkt som reagerer med OxiRed probe for å produsere fluorescens. Titrering er nøyaktig, følsom og kan oppnås på celleekstrakter eller vevssnitt. Imidlertid, i motsetning til andre teknikker, det gir ikke informasjon om fordeling av glykogen i cellen. Som et eksempel på denne teknikk, beskriver vi her titreringen av glykogen i to cellelinjer fra kinesisk hamster lunge fibroblast CCL39 og human colon carcinoma LS174, inkubert i normoksiske (21% O 2) mot hypoksi (1% O 2). Vi antok at hypoksi er en signal som forbereder celler til å syntetisere og lagre glykogen for å overleve en.
Introduction
Glykogen er en multibranched polymer av glukoserester, som er til stede i cytoplasma av mange celletyper. Det er en av de viktigste former for energilagring i celler, og spiller en viktig rolle i glukosemetabolismen. De fleste pattedyrceller er i stand til å produsere og lagre glykogen, som kan bli hurtig nedbrutt til glukose for å fremme glykolyse og ATP-produksjon ved metabolsk stress. Hepatocytter produserer enorme mengder glykogen å regulere blodsukkeret derved å tilveiebringe en kontinuerlig tilførsel av glukose i kroppen. I motsetning til dette er konsentrasjonen av glykogen i andre celler (muskler, røde blodceller, osv.) er relativt lav. Imidlertid lokalt, disse mengder er tilstrekkelig til å gi energi på kort sikt når cellene blir plutselig eksponeres for et miljø ute av næringsstoffer.
Glykogen syntese og glykogen sammenbrudd følger de samme trinnene i alle vev (figur 1). For det første, glukosegår inn i celler ved glukosetransportører (gluts), og raskt omdannes fra glukose-6-fosfat (G6P) til glukose-1-fosfat (G1P) av phosphoglucomutase. G1P blir deretter omformet til UDP-glukose, og karbon C1 av UDP-glukose er festet til en tyrosin-rest av glycogenin, forankrings protein av glykogen. Dette molekylet, muligens en glykogen-primer, er utvidet ved feste av UDP-glukose til terminalen glukose ved en α (1 → 4) bindingen gjennom glykogensyntase. Til slutt, når en lineær kjede med mer enn 11 glukoserester er dannet, overfører den forgrenede enzymet terminal oligosakkarid som utgjøres av minst 6 glukoserester til et annet glukose av kjeden i nærheten gjennom en α (1 → 6) binding. Gjentagelse av denne prosessen gir en massiv fraktal struktur som inneholder grener som danner en helix med 6,5 glukose per omdreining. Glykogen kan være reversely hydrolysert til glukose ved samordnet aksjonav debranching enzymer som hydrolyserer den α (1 → 6) bundet og glykogen-fosforylase som hydrolyserer den α (1 → 4) glykosidisk bundet mellom den siste rest av glukose i en gren og glykogen molekylet. Denne reaksjon kalles glykogenolyse aktiveres ved å øke nivået av AMP (reflekterer ATP-forbruk), og hemmet av glukose og ATP 2,3.
Ved elektronmikroskopi, har glykogen-molekyler blitt beskrevet i mange celletyper som β frie partikler (eller glykogen monoparticles) på 15-30 nm i diameter. I spesifikke celletyper som for eksempel leverceller, kan β partikler settes sammen til et komplekst til å danne rosetter, også kjent som α partikler som varierer i diameter fra 80 nm til et maksimum på 200 nm 4 </sup>. Måten disse β partikler er bundet for å danne større klynger av α partiklene er fortsatt ikke fullstendig klarlagt. Noe bevis har en tendens til å bevise at β partikler kan være bundet ved kovalent binding 5, hydrogenbinding, eller til og med gjennom protein-protein interaksjoner 6. Mengden av glykogen som er lagret i cellene avhenger av mange parametre: (I) mengden glycogenin i cellen som initierer glykogensyntese, (II) aktiviteten av glykogen-syntase og fosforylase regulert av protein phosphorylation / dephosphorylation, (III) konsentrasjonen av glukose i cellene, noe som er avhengig av flere parametre slik som tilførsel av glukose fra det vaskulære system og glukoseopptak i celler. Glykogenlagrene er strengt regulert av allosterisk regulering av biosyntetiske hormoner gjennom mellomliggende metabolitter, av hormoner som regulerer energiomsetningen, og ved næringsfølesignalveier 7.
Det er viktig å være istand til å kvantifisere glykogen i biologiske prøver for å bedre forstå betydningen av glykogen metabolisme på hele kroppen og cellenivå. Vi beskriver her en presis, reproduserbar og praktisk biokjemiske in vitro assay for glykogen. Denne teknikken er basert på kvantifisering glukose fluorescens før og etter spesifikk hydrolyse av glykogen.
Andre metoder foreligger for å anslå graden av glykogen i cellene, men de fleste av dem er ikke kvantitativ. En av de første teknikkene som er beskrevet for kvantifisering av glykogen i cellene var basert på måling av [14C]-glukose til glykogen inkorporering 8,9. Bruken av radioaktiviteten som gjør denne prosessen vanskeligere å håndtere, men den har fordelen av å gi en hastighet på glukose innlemmelse i glykogen og skille mellom fordelingen av glukoserester på de ytre grener og i kjernen av molekylet (det også kreves en ekstra β-amylolysis og en kromatografisk trinn). En annen teknikk som ble utviklet senere, og er basert på inkorporering av 2-NBDG (2 – {N-[7-nitrobenz-2-oksa-1 ,3-diazol-4-yl] amino}-2-deoxyglucose), et 2-deoxyglucose fluorescerende derivat, til glykogen 10. Den målte fluorescensintensiteten reflekterer mengden av glykogen som produseres og kan måles med et fluorescens-leser. Fordeling av fluorescens i cellen kan også bli evaluert ved konfokal mikroskopi.
Blant de andre nonquantitative teknikker, er periodsyre-Schiff-farging (PAS) kanskje den vanligste. Den kan brukes for påvisning av glykogen i faste celler, vev-seksjoner i parafin eller frosset. Dette histologiske teknikk farger ikke spesielt polysakkarider, glykolipider, glykoproteiner, cellulose og nøytrale mucins i lilla. Spesifisiteten til denne testen kan økes ved behandling av faste celler eller vev-seksjoner med diastase, som spesifikt digests glykogen. Deretter,nivået av glykogen kan kvalitativt estimert ved å sammenligne unhydrolyzed prøver (alle karbohydrat-modifisert makromolekyler) til hydrolyserte prøver (karbohydrat modifisert makromolekyler med unntak av glykogen). PAS-farging og mikroskopisk analyse, i motsetning biokjemiske analyser av glykogen, inneholder informasjon angående fordelingen av glykogen i cellen, noe som kan bli spredt eller konsentreres i en bestemt del av cellen. Men selv om PAS fargingsestimater forskjeller i glykogen akkumulering mellom forskjellige forhold, er det ikke kvantitativ 11..
Monoklonalt mus antistoff opprinnelig laget ved hjelp av kjeve condylar brusk som antigenet er vist å reagere med glykogen i celler og med renset glykogen in vitro 12.. Ettersom dette antistoff spesifikt gjenkjenner glykogen-relaterte sukkerkjeder, er det et nyttig verktøy for påvisning av glykogen ved immunhistokjemi i en mer spesifikk måte enn PAS farging. </p>
Elektronmikroskopi er en annen teknikk som tillater visualisering av korn av glykogen i celler og evaluering av graden av glykogenlagring. Faktisk, glykogen β partikler er lett gjenkjennelig med en elektronmikroskopi som elektron tette granuler en.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biokjemisk titrering av glykogen in vitro gir en nøyaktig kvantifisering av celler glykogeninnhold. Sammenlignet med noen andre teknikker (PAS, immunfluorescens med en glykogen antistoff, etc.), Er dette titrering veldig spesifikk, sensitiv og reproduserbar. Dessuten er fremgangsmåten fordelaktig siden det krever ingen radioaktivitet, men en fluorescens-spektrometer. Imidlertid er denne teknikk rent kvantitativ, og ikke gi informasjon om fordeling glykogen i cellen.
Den t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Dr. Thierry Pourcher for å tillate oss å bruke fluorescens spektrometer og for hans hjelp. Laboratoriet er finansiert av Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), Foreningen pour la Recherche contre le Cancer, Institut National du Cancer (INCA), Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU program FP7), Senter A. Lacassagne, den Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE og Universitetet i Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Vi takker Dr. M Christiane Brahimi-Horn for kritisk lesing og redaksjonell korreksjon.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. “Fluorescent glycogen” formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
