高分辨率显微镜与常规和全息光学捕获能力建设

Summary

本文介绍的系统采用传统的光陷阱，以及一个独立的全息光阱线，能够创建和操作多个陷阱。这使得创建复杂的几何安排的折光颗粒，同时还允许同时高速，高分辨率测量生物酶的活性。

Abstract

光阱的高清晰度显微镜系统允许精确地操纵各种折射对象，如电介质有孔玻璃珠¹或细胞器^2,3，以及对高时空分辨率读出他们的相对位置的陷阱中心。本文描述的系统有一个这样的“传统的”陷阱在980 nm处的作业。另外还提供了一个第二光学捕获系统，采用市售的全息包，同时在图^4,5在波长为1064 nm的显微镜领域的创建和操作复杂的俘获模式。这两个系统的组合允许在同一时间的多个折射对象的操纵的同时进行高速和高分辨率的测量，运动和力的生产纳米和微微牛顿规模。

Introduction

光学俘获生物物理学⁶中的关键技术之一。一个关键的进步一直在光学诱捕的发展全息陷阱允许创建三维俘获模式，而不是传统的点陷阱^7。这种全息陷阱具有定位屈光对象的通用性的优点。然而，传统的陷阱，可以很容易地对准更对称比市售全息套件。他们还允许被困物体的快速精确跟踪。这里，我们描述的系统（ 图1）相结合的两个捕集方法在一台仪器中，并允许用户利用的好处，同时以适当的。

建设光陷阱（基于单个或多个激光束）的一般考虑别处^8-10详细讨论。在这里，我们勾勒出具体考虑我们的Setup并提供细节，我们的校准程序。比如，已经描述了两束光俘获系统之前（ 例如，参考文献^11），用于捕集的折射率的对象去耦读出捕获的对象的位置和使用的其他（故意低功率波束），通常使用一个激光束。然而，在这里，两个激光束的高功率（300 mW或更高），因为两者都是用于俘获。对于生物系统的测量，激光器用于诱捕最佳应该属于一个特定的波长的近红外窗口，以尽量减少光诱导蛋白降解^1。在这里，我们选择了使用980 nm的二极管和1,064 nm的DPSS激光器，因为其低成本，高可用性和易于操作。

我们也选择了使用空间光调制器（SLM）创建和操纵多个陷阱，同时在实时^4,5。这些设备是市售的但是他们整合成一个完整的设置提出了独特的挑战。在这里，我们描述了一个切实可行的办法，解决这些潜在的困难，并提供了一​​个高度灵活的工具。我们提供了一个明确的例子具体描述的设置，可以用来作为一个指南的修改设计。

Protocol

1。安装980 nm波长单光阱

1. 在980纳米波长的光学俘获往往是最佳的生物物理学实验和廉价的激光二极管输出功率高达300毫瓦都是现成的。这是优选的公知的模场直径的单模光纤，其与保偏尾纤的二极管激光器。需要足够长，以作为模式过滤器的纤维，通常是与任何一个FC / PC或FC / APC连接终止。其中，FC / APC是可取的，以尽量减少反射光不稳定和潜在的反馈。
2. 980 nm激光二极管固定在山上，它允许电力和温控。这是最好的修复直接安装到光学平台，以最大限度地提高被动散热，从而减少二极管失灵的危险，由于温度控制器故障。
3. PC / APC光纤连接器安装的光束准直光学。这是关键，以保证准直光束有最小的发散，所以是最有用的可调光纤端口。确保所选择的光纤端口匹配二极管尾纤光纤的模场直径。如果光束是使用声光偏转器（AOD）或电光偏转器的光栅（EOD）的准直激光束腰身也必须是略小于偏转器孔径的大小。
4. 以足够的距离，从显微镜的准直适配器固定在光学平台上，以允许束路由，扩展和其他所需的组件的位置。调整纤维港口整体束路径显微镜相媲美的距离，以确保一致的束腰。
5. 安装在图1中所示的反射镜。从显微镜中取出目标，并用反射镜将光束通过客观安装阶段中的孔中。如果优选，分色镜DM1和DM3的放置可以被省略，直到后来。 DM2和DM3而都shortpass透过可见光，同时反射近红外及以上。
6. 是有帮助的暂时安装，对准显微镜的光轴上的红色激光指针代替的客观。一个自定义的的机械适配器是必要的，以确保中心定位的激光指针。从激光指示器的可见光束，然后可以回路由光纤端口的光圈的中心，然后，可以使用安装的透镜（见下文）。
7. 安装980 nm的扩束（L8和L9）在适当的距离的光纤端口，允许未来插入转向组件（AOD或EOD）为必要^1。扩束必须稍微装得过满后焦距光圈的客观。 （在这里，125毫米和60毫米焦距的透镜是在约两倍的光束束腰的开普勒安排）。可见激光指针梁（参见1.6节），以确保适当的镜头的位置和粗调。
8. 安装l为980纳米转向镜头（L2和L3）望远镜安排在（这里都有60毫米焦距^）1。 L3被安装在一个平面上的共轭物镜的后焦平面。贴装，L3上的一个精确的XYZ定位阶段，以允许光束转向。它是有帮助的XYZ阶段有其微米的数字指标，允许重复定位和重新定位的陷阱。 0.5“范围内的旅行通常是足够的，但是更长的旅行沿光轴L3定位可能会有所帮助。使用可见的激光笔光束（参见1.6节），以确保适当的镜头的位置和粗调。

2。激光探测器的安装

1. 安装DM3，冷凝器的二向色反射镜，如在图1中示出。通常需要一个自定义安装。四光电二极管（QPD）或位置敏感探测器^（PSD）8固定侧的冷凝器组件和ENSURE 980 nm激光束反射的DM3击中它大致的中心。当使用QPD，确保它被安装在一个小的XY载物台以允许上的激光束的传感器的精确的定心。
2. 安装L1（通常是30毫米镜头）DM3和传感器之间。位置L1，以将光束聚焦到一个点上的传感器。
3. 安装之前L1阻止的1064 nm的光束以及从显微镜任何杂散的可见光反射照明器和环境照明的陷波滤波器。

3。安装的1,064 nm波长全息陷阱

1. 全息设置的一部分是围绕市售硬件/软件包，这个软件包中使用的全息反射镜被评为5或10瓦/厘米²的最大入射功率。单模式TEM00光束在这个功率范围内，可以很容易地来源于一个1,064 nm波长的DPSS激光器。
2. 在高架安装1,064 nm激光平台，以大致为980线（参见第1）的光束路径的高度相匹配。
3. 如果不是直接控制，可手动调整激光功率，通过安装一个半波片（HWP）和偏振器（PBS）后激光输出孔。是有帮助的偏振器安装在一个旋转的阶段，能够匹配光束偏振全息镜要求。
4. 安装1,064 nm的扩束（L6和L7）。必须扩大相匹配的对角尺寸的全息镜的激光光束束腰。对于较大的膨胀比（大于10倍），它可能是一个关注的保持膨胀​​机的大小小。因此，它可能是可取的，与异常小的焦距（这里使用镜头：16毫米和175毫米）。
5. 安装其他镜像1,064纳米束直接通过目标。
   1. 安全的DM1分色（45°的入射角）运动的安装和装配在980纳米光束路径，以便，它允许undiminishe的ð传输，光束。
   2. 启动雷射光束。 DM1镜应反映可见光的足够量的，适当地定位该光束的路径中的空间光调制器（SLM）。在SLM也需要的角度，​​从而使输入和输出的激光束的正常发生率尽可能接近。然而，入射角必须足够大，以确保激光束由透镜轴承，及其他光学部件不剪切。 5°的角度应该是容易实现的，足够小。最后的距离DM1到SLM必须进行精确测量，从而使插入的透镜L4和L5（见下文3.6）共轭的的SLM反射镜平面和物镜的后焦平面。
   3. 安装镜子直接从1,064 nm的扩束光的SLM。确保雷射光束扩束击中孔径中心。
6. 安装镜头L4和L5（这里：12镜头5毫米和200毫米）。此望远镜对共轭物的SLM反射镜平面的物镜的后焦平面，也减少了只是稍微过满的目标回光圈的光束束腰。我们选择了长焦距的镜头空间的SLM远离DM1。这不仅清除第二激光线的空间，但也往往使取向变得更容易。
7. 拆下激光指针。离开安装适配器作为粗对准光圈。

4。系统安装和校准附注

1. 透镜L3和SLM必须定位成光学共轭的后焦面的客观。 L4和L5的共同焦点的样品平面光学共轭的，如果的光俘获束显微镜的无限空间注入。
2. 唱IR卡浏览器在980 nm的光束对准一起去激光指针适配器中的孔的中心轴线。
3. 使用红外感应卡考勤确保1064 nm的光束击中DM1，L2和L3和1064 nm的光束沿着激光指针适配器中的孔的中心轴线的相同点为980 nm的光束。
4. 更换一个客观的激光指针安装适配器。高数值孔径的油或水的目标，是典型的。
5. ⁹中所描述的“行走”的径向对称的干涉图案的激光束，直到在相机上看到的980 nm的陷阱对齐。
6. 随着全息镜像关闭（ 即作为一个被动的镜子）使用SLM和DM1“走”未衍射1,064 nm的光束对准1064nm的陷阱。
7. 在SLM产生了显着的未衍射光束产生一个强有力的不可移动的激光陷阱中的视场。对应的，这是非常有用的，但可能是不理想的实验。为了阻止这个陷阱，一个可以插入一个小的不透明的对象未衍射的光的路径中，在样品平面共轭的位置（ 例如，第É共同的焦点，L4和L5）。此中央点阻滞剂的大小需要是稍微大于艾里斑的直径为聚焦光（100-300微米直径的所描述的系统中的阻断剂）。
8. djust 1,064纳米束使用偏光镜的偏振，到SLM方向相匹配。旋转的半波片，然后随意设定光束的输出功率。
9. 如果需要，插入到980 nm激光线AOD或排爆光束转向元素。确保适当结合这些元素的后焦平面的目标，并重新调整的陷阱。安装在方向盘测角舞台上的元素是很有帮助的。

Representative Results

组设置，使操作员可以实时捕获多个折射对象，并将其放置在所有三个维度中，在视场之内。我们说明了仪器的性能后的全息，捕集微球11（ 图2）。限制每个对象的陷阱手动重新定位时捕获最后的安排，犹他州立大学的这个实验进行描绘的标志。合的功能的全息和常规陷阱如图3所示。传统的陷阱中央珠移动速度越来越快（1.3，10和82微米/秒的速度陷阱），而全息定义的陷阱，保持静止。在最高转速下，胎圈的整个运动过程中发生的记录的一帧视频，从而出现极端的运动模糊。这是可能的足够快，有孔玻璃珠由h的势阱被强行移动至常规的陷阱ydrodynamic拖动（未示出）。

需要注意的是利用多个微球体的组件的复杂的形状可能导致的情况下，微球的视场的数量是不够完整的组件（在图2中这是显而易见的）。在这种情况下，运营商需要物理地移动的视场相对于样品（ 即重新定位在显微镜样品台），以暴露额外的微球，同时保留已经捕获的对象。

图1。两个诱捕梁高分辨率显微镜系统示意图。组件标记为L1-L9基本镜头。组件标记DM1-DM3分色镜。透镜L2和L3被用于转向。镜头L4和L5作为一个BEA米减速和间隔。镜头L6/L7，L8/L9为各自的激光光束扩束对。未标注的成分为纯黑色矩形所描述基本镜子。标记MC和MO组件显微镜冷凝器和对象。其他组件是四光电二极管（QPD），的，陷波滤波器（NF），帕尔帖温度控制器阶段（PTC），热过滤器（HF），空间光调制器（SLM），声光偏转器（AOD），百叶窗（S1和S2）时，半波片（HWP），偏振分束器（PBS）。

图2。大学的犹他的标志是由一个空间安排使用11个运营商定义和控制的全息陷阱。被困的对象是屈光珠（ 见表材料更德泰LS）悬浮在去离子水。红色和绿色的圆圈显示陷阱位置。帧（A） - （F）表示连续的标志建设阶段。

图3。两排陷阱是使用6操作者界定和控制的全息陷阱。另外一个传统的陷阱之间的两行和它的位置被定义以各种速度进行调整。胎圈移动到一个最大的空间位移为4.1微米，然后再返回到原来的位置。珠运动被记录在47 fps的视频。陷阱重新定位的速度增加，逐渐变大的运动模糊视频中观察。被困的对象是屈光珠（更多的细节材料见表 ）悬浮在去离子水。神父AME计时显示为红色。陷阱重新定位速度显示的每一行。绿色比例尺对应在每个方向5微米。

Discussion

我们已经构建了一个仪器，结合了两种不同类型的光学陷阱（ 图1），以提供独立的诱捕设施为对象的操作和测量。 980纳米激光二极管围绕“常规”光陷阱。被扩展时，该光束转向，然后注射到我们的倒置显微镜（“浅红色”束在图1中）。是围绕一个1,064 nm的DPSS激光全息光学陷阱。束被扩展以适应大小的空间光调制器（SLM）的SLM，减少在低入射角稍微过满的后焦光圈的目标，与“常规”俘获线相结合使用的二向色反射镜，最后注入的是我们的显微镜（“暗红色”束在图1中）。需要注意的是在SLM必须被放置在一个平面，该平面光学共轭的后焦面的客观。

在原山坳节中，我们描述了设计及走线的考虑，使我们能够最大限度地减少空间所带来的设置和启用相对容易建设。我们还描述了由空间光调制器产生的未衍射元件，使用类似的系统的一个商业包装，这可能是必要的，但有些是具有挑战性的，和最新的记录不阻塞。

这里所描述的设计是高度可定制。我们已简要提到的几个流行的高级定制光学陷阱，以及如何将整合到我们的设计。例如，一个单一的陷阱可以转向以多种方式，包括声光偏转器（AOD），电光偏转器^{（EOD）12，}可移动的或可变形的反射镜或光栅的的转向透镜（L3在我们的设置^）1。同样，一个被困对象的位置，可以使用许多计划和传感器确定。在这种情况下，典型的放置和对齐的相关组件进行了简要介绍。我们预计，这项工作可能在未来更复杂的设计提供了一个模板。

一些实际情况和使用限制说明。首先，不应该被定位的光陷阱彼此太靠近，以便不干扰他们有吸引力的电位附近的陷阱中心。如果需要紧密定位的两个陷阱，那么很可能连接使吸引力的潜在的陷阱沿着整条生产线的两点来定义一条线的陷阱。另一个实际问题是，被困的对象不能被移动如此之快，他们遇到过多的流体阻力（确切的阈值取决于陷阱强度），否则拖动可以推对象跳出陷阱。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (cabron-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL