Summary
O sistema aqui descrito emprega uma armadilha óptica tradicional, bem como uma linha de captura óptica holográfica independente, capaz de criar e manipular múltiplas armadilhas. Isso permite a criação de disposições geométricas complexas de partículas de refração e ao mesmo tempo permitindo medições simultâneas de alta velocidade, de alta resolução da atividade de enzimas biológicas.
Abstract
Sistemas de microscópio de alta resolução com armadilhas ópticas para permitir uma manipulação precisa de vários objectos de refracção, tal como esferas de dieléctricos um ou organelas celulares 2,3, bem como para a leitura de alta da sua posição em relação ao centro do colector de resolução espacial e temporal. O sistema aqui descrito tem uma tal "tradicional" armadilha operando a 980 nm. Ele proporciona adicionalmente um segundo sistema de captação óptica que utiliza um pacote holográfico disponível comercialmente para criar e manipular simultaneamente padrões de armadilhagem complexas no campo de visão do microscópio de 4,5 a um comprimento de onda de 1064 nm. A combinação dos dois sistemas permite a manipulação de múltiplos objectos de refracção, ao mesmo tempo, ao mesmo tempo realizando medições de alta velocidade e de movimento de alta resolução e de produção de força em escala nanométrica e piconewton.
Introduction
A armadilha óptica é uma das principais técnicas na biofísica 6. Um avanço importante na captura óptica tem sido o desenvolvimento de armadilhas holográficas que permitem a criação de padrões de armadilhagem tridimensionais, em vez de pontos de armadilhas convencionais 7. Tais armadilhas holográficos possuem a vantagem de versatilidade no posicionamento de objetos de refração. No entanto armadilhas convencionais podem ser facilmente alinhadas para ser mais simétrico do holográficas kits disponíveis comercialmente. Eles também permitem um controle preciso rápido dos objetos presos. Aqui, nós descrevemos um sistema (Figura 1), que combina as duas abordagens de armadilhagem num instrumento e permite que o utilizador para explorar os benefícios de ambos, conforme apropriado.
As considerações gerais de construção de armadilhas ópticas (baseado em feixes de laser simples ou múltiplas) são discutidos em detalhe noutro local 8-10. Aqui, destacamos as considerações específicas para o nosso setup e fornecer detalhes do nosso processo de alinhamento. Por exemplo, os sistemas com dois feixes de armadilhagem ópticas foram descritos antes (por exemplo, ref. 11), tipicamente utilizando um feixe de laser para capturar um objecto de refracção e usando a outra (intencionalmente baixo feixe de energia) para a leitura dissociada da posição do objecto preso . Aqui, no entanto, ambos os feixes de laser precisa ser de alta potência (300 mW ou superior), pois ambos são para ser usado para captura. Para as medições dos sistemas biológicos, os lasers utilizados para aprisionamento optimamente deve cair dentro de uma janela de comprimento de onda NIR específico de luz para minimizar a degradação da proteína induzida por 1. Aqui, optou-se por usar diodo 980 nm e 1064 nm lasers DPSS por causa de seu custo, alta disponibilidade e facilidade de operação baixa.
Também optou por usar um modulador de luz espacial (SLM) para criar e manipular várias armadilhas simultaneamente em tempo real, 4,5. Estes dispositivos estão disponíveis comercialmenteno entanto a sua integração numa configuração completa apresenta desafios únicos. Aqui nós descrevemos uma abordagem prática, que aborda estas dificuldades potenciais e fornece um instrumento muito versátil. Fornecemos uma lista explícita para a configuração específica descrita, que pode ser usado como um guia para modelos modificados.
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Protocol
1. Instalação de 980 nm de comprimento de onda Armadilha Único Optical
- Captura óptica a 980 nm de comprimento de onda é muitas vezes ideal para experimentos biofísica e diodos laser de baixo custo estão disponíveis com potência tão alta quanto 300 mW. É preferível que um laser de diodo ser pigtailed com polarização preserva fibra monomodo com um diâmetro de campo do modo conhecido. A fibra deve ser suficientemente longo para actuar como um filtro de modo e é normalmente terminado com um ou FC / PC ou FC / APC conector. Destes, o FC / APC é preferível para minimizar a reflexão da luz e instabilidades de feedback potencial.
- Fixe o laser de diodo 980 nm em uma montagem que permite a potência e controle de temperatura. É melhor para corrigir a montagem de uma mesa óptica diretamente para maximizar dissipação de calor passivo e, assim, minimizar o risco de fracasso diodo devido a uma avaria do controlador de temperatura.
- Monte o conector de fibra PC / APC para as lentes de colimação do feixe. Écrítico para assegurar que o feixe colimado tem divergência mínimo para portas de fibra ajustáveis são mais úteis. Certifique-se de que a porta de fibra escolhido coincide com o diâmetro da fibra pigtail diodo campo de modo. Se o feixe é para ser rastered utilizando os deflectores acusto-óptica (AOD) ou deflectores electro-ópticos (EOD), então o feixe de laser colimado cintura também deve ser um pouco menor do que o tamanho da abertura do deflector.
- Fixar a placa de colimação para a mesa óptico a uma distância suficiente para permitir que o microscópio para o feixe de encaminhamento, a expansão, e colocação de outros componentes desejados. Ajustar a porta de fibra para assegurar cintura do feixe coerente sobre distâncias comparáveis às caminho global feixe ao microscópio.
- Instalar espelhos indicados na Figura 1. Remover o objectivo do microscópio e utilizar os espelhos de percurso do feixe através da abertura em fase de montagem na objectiva. Se preferido, o posicionamento do espelho dicróico DM1 e DM3 pode ser omitido atémais tarde. DM2 e DM3 são ambos shortpass e transmitir luz visível, enquanto refletindo próximo IR e acima.
- É útil para montar temporariamente um ponteiro laser vermelho no lugar do objectivo, alinhados no eixo óptico do microscópio. Um adaptador mecânico personalizado é necessário para garantir a centralização do ponteiro laser. Feixe visível a partir do ponteiro laser pode então ser encaminhada de volta para o centro da abertura da porta de fibra e podem, então, ser usadas para instalar as lentes (ver abaixo).
- Instale a 980 nm expansor de feixe (L8 e L9) a uma distância adequada do porto de fibra para permitir a inserção futura de componentes de direção (AOD ou EOD), se necessário 1. O feixe expandido deve encha um pouco a abertura focal de trás do objetivo. (Aqui, as lentes com distâncias focais de 125 milímetros e 60 milímetros estão em um arranjo de Kepler para aproximadamente o dobro da cintura do feixe). Use visível feixe de laser pointer (ver secção 1.6) para assegurar a colocação de lente adequada e alinhamento áspera.
- Instalarl os 980 nm lentes de direção (L2 e L3) em um arranjo telescópio como indicado (neste caso, ambos têm 60 mm de distância focal) 1. L3 é montado em um conjugado de avião para o avião de volta-focal da objetiva. Montagem L3 numa fase de posicionamento XYZ precisão para permitir a direcção do feixe. É útil para a fase XYZ dispor de indicadores digitais para as suas micrómetros, o que permite um posicionamento repetitivo e reposicionamento da armadilha. A "faixa de deslocamento de 0,5 é geralmente suficiente, porém mais viajar para o posicionamento L3 ao longo do eixo óptico pode ser útil. Use visível feixe de laser pointer (ver secção 1.6) para assegurar a colocação de lente adequada e alinhamento áspera.
2. Instalação de Detector Laser
- Instalar o DM3 espelho dicróico acima do condensador, como mostrado na Figura 1. Uma montagem personalizada é normalmente necessária. Fixe a foto diodo quad (QPD) ou um detector sensível à posição (PSD) 8 ao lado do conjunto do condensador e ensure que a 980 nm raio laser refletido pela DM3 é batê-lo mais ou menos sobre o centro. Ao utilizar QPD, assegurar que é montado sobre uma plataforma XY pequenos para permitir a centragem exacta do sensor sobre o feixe de laser.
- Instalar L1 (tipicamente uma lente de 30 mm) entre DM3 e o sensor. Posição L1 de modo a focar o feixe para um único ponto sobre o sensor.
- Instale o filtro notch pouco antes L1 para bloquear o feixe de 1064 nm, bem como quaisquer reflexos de luz visíveis desviar-se do iluminador microscópio e iluminação ambiente.
3. Instalação de 1.064 nm de comprimento de onda holográfica Armadilha
- A parte holográfica da instalação é construído em torno de um pacote de hardware / software disponível comercialmente Os espelhos holográficos usados neste pacote são classificados para uma potência máxima incidente de 5 ou 10 W / cm 2. Monomodo TEM00 vigas nesta faixa de potência pode ser facilmente obtida a partir de um laser DPSS em 1064 nm de comprimento de onda.
- Monte o laser de 1.064 nm em um elevadoplataforma para corresponder aproximadamente a altura do trajecto do feixe para a linha 980 (ver ponto 1).
- Se não diretamente controlável, potência do laser pode ser ajustado manualmente através da instalação de uma placa de meia onda (HWP) e um polarizador (PBS) logo após a abertura da saída do laser. É útil para montar o polarizador numa fase rotativo para ser capaz de combinar requisito espelho holográfica para a polarização do feixe.
- Instale a 1064 nm expansor de feixe (L6 e L7). A cintura do feixe de laser deve ser expandido para corresponder ao tamanho diagonal do espelho holográfico. Para taxas de expansão grandes (acima de 10X), pode ser uma preocupação de manter o tamanho do expansor pequena. Assim, pode ser desejável a utilização de lentes com invulgarmente pequeno comprimento focal (aqui: 16 mm e 175 mm).
- Instale os outros espelhos conforme indicado para dirigir o feixe de 1064 nm através da objectiva.
- Seguro DM1 dicróica (45 ° de ângulo de incidência) em uma montagem cinemática e coloque o conjunto no caminho do feixe de 980 nm a fim de que ele permite undiminishea transmissão d desse feixe.
- Ative luz ponteiro laser. O espelho DM1 deve reflectir uma quantidade suficiente de luz visível, para posicionar adequadamente o modulador de luz espacial (SLM) no caminho desse feixe. O SLM também precisa ser inclinado para que os feixes de laser de entrada e saída são tão próximas quanto possível da incidência normal. No entanto, o ângulo de incidência deve ser suficientemente grande para assegurar que o feixe de laser não é recortado por montagens de lente e outros elementos ópticos. Um ângulo de 5 ° deve ser facilmente alcançável e é suficientemente pequena. Finalmente, a distância entre a DM1 SLM devem ser medidos com precisão de modo que a inserção de lentes de L4 e L5 (ver 3.6) pode conjugar o plano do espelho SLM e o plano de back-focal da objectiva.
- Instale um espelho para direcionar a luz a partir de 1064 nm expansor de feixe para o SLM. Certifique-se de que a luz ponteiro laser atinge o expansor de abertura do feixe de centro.
- Instale lentes L4 e L5 (aqui: lentes com 125 milímetros e 200 milímetros, respectivamente). Este par telescópio conjuga o plano do espelho SLM para o plano focal da objetiva e também reduz a cintura do feixe, apenas encha um pouco a abertura de trás do objetivo. Nós escolhemos lentes com distâncias focais longas para o espaço o SLM longe de DM1. Isto não só sala limpa para a segunda linha de laser, mas também tende a tornar mais fácil o alinhamento.
- Remover o ponteiro laser. Deixe o adaptador de montagem para servir como abertura alinhamento grosseiro.
4. Instalação e Alinhamento Notas do sistema
- Lente L3 e SLM deve ser posicionada de modo a ser opticamente conjugados com o plano focal posterior do objectivo. O ponto focal comum de L4 e L5 é opticamente conjugados com o plano da amostra, se os feixes de armadilhagem ópticos são injectados no espaço infinito do microscópio.
- cantar IR espectador cartão alinhar o feixe de 980 nm para ir ao longo do eixo central da abertura do adaptador ponteiro laser.
- Use IR placa to assegurar que o feixe atinge 1.064 nm no mesmo lugar que o feixe de 980 nm em DM1, L2 e L3 e que o feixe de 1064 nm, passa ao longo do eixo do centro da abertura na placa de ponteiro laser.
- Substitua o adaptador de montagem ponteiro laser com um objetivo. Alta do petróleo ou água objetivo abertura numérica é típico.
- Alinhar a armadilha 980 nm tal como descrito em 9, de "walking" do feixe de laser até um padrão de interferência radial simétrico é visto na câmara.
- Com o off espelho holográfico (ou seja, agindo como um espelho passivo) usar SLM e DM1 a "andar" a undiffracted 1064 feixe nm para alinhar o nm armadilha 1064.
- A SLM produz um feixe undiffracted significativa que resulta numa forte armadilha de laser inamovível no campo de visão. Isto é útil para alinhamento, mas podem ser indesejáveis para fins experimentais. Para bloquear esta armadilha pode-se inserir um pequeno objecto opaco no caminho da luz undiffracted no conjugado de localização para o plano da amostra (por exemplo, poe ponto focal comum de L4 e L5). O tamanho desse bloqueador ponto central tem de ser um pouco maior do que o diâmetro do disco de Airy para a luz focalizada (um bloqueador com 100-300 um de diâmetro para que o sistema descrito).
- djust 1064 nm polarização do feixe usando o polarizador para coincidir com a orientação SLM. Girar a placa de meia onda para ajustar a potência do feixe de saída, como desejado.
- Se desejar, inserir AOD ou EOD elementos de orientação do feixe para a linha de laser 980 nm. Assegurar a correcta conjugação desses elementos para o plano de back-focal da objetiva e re-alinhar a armadilha. É útil para montar os elementos de direção em um palco goniométrico.
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Representative Results
A configuração de montagem permite que o operador para prender múltiplos objectos de refracção em tempo real e posicioná-los em todas as três dimensões dentro do campo de visão. Nós ilustramos os recursos holográficos do instrumento, prendendo 11 microesferas (Figura 2). A armadilha confinando cada objeto é manualmente reposicionada sobre armadilhas para que o acordo final mostra o logotipo da Universidade de Utah, onde este experimento foi realizado. Uma função combinada de armadilha holográfica e convencional é mostrado na Figura 3. A armadilha convencional move centro talão progressivamente mais rápida (velocidades armadilha de 1,3, 10 e 82 mM / seg são mostrados), enquanto armadilhas holograficamente definidos permanecer parado. Na velocidade mais alta, o movimento inteiro do cordão ocorre durante a gravação de um quadro de vídeo e, portanto, parece motion blur como extremo. É possível deslocar a armadilha convencional com rapidez suficiente grânulos que são forçados a partir do potencial de armadilhagem por hydrodynamic arrasto (não mostrado).
Note-se que o conjunto de formas complexas, utilizando microesferas múltipla pode levar a um caso em que o número de microesferas no campo de visão não é suficiente para a montagem completa (como é evidente na Figura 2). Em tais casos, o operador tem de deslocar fisicamente o campo de visão em relação à amostra (isto é, reposicionar a fase de amostra no microscópio) para expor microesferas adicional, mantendo os objectos já presas.
Figura 1. Esquemático do sistema de microscópio de alta resolução com dois feixes de armadilhagem. Componentes rotulados L1-L9 lentes são básicos. Componentes rotulados DM1-DM3 são espelhos dicróicas. Lentes de L2 e L3 são utilizados para a condução. Lentes de L4 e L5 ato como um beam redutor e espaçador. Lentes L6/L7 e L8/L9 são pares expansor de feixe para os seus respectivos feixes de laser. Componentes sem rótulos representados como retângulos pretos sólidos são espelhos básicas. Componentes rotulados MC e MO são o condensador do microscópio e objeto, respectivamente. Outros componentes são um fotodiodo quad (QPD), filtro de corte (NF), estágio controlador de temperatura Peltier (PTC), filtro quente (HF), modulador de luz espacial (SLM), defletor acústico-ótico (AOD), estores (S1 e S2), placa de meia onda (HWP) e o divisor de feixe de polarização (PBS).
Figura 2. A disposição espacial que representa uma Universidade de Utah logotipo é feita através de 11 armadilhas operador holográficas definidas e controladas. Os objetos presos são contas de refração (ver Tabela de Materiais para mais detls) suspenso em água desionizada. Os círculos vermelhos e verdes mostram as posições armadilha. Quadros (a) - (f) representam fases sucessivas da construção logotipo.
Figura 3. Duas linhas de armadilhas são feitas usando 6 operador armadilhas holográficas definidas e controladas. Uma armadilha convencional adicional é definida entre as duas linhas e a sua posição é ajustada a diferentes velocidades conforme indicado. O talão é movido para um deslocamento espacial máxima de 4,1 mM e depois de volta para o local original. Um vídeo do movimento do grânulo é gravado em 47 fps. A armadilha é aumentada a velocidade de reposicionamento, progressivamente maiores motion blur é observado no vídeo. Os objetos presos são contas de refração (ver Tabela de Materiais para mais detalhes) suspensas em água deionizada. Frame horários são mostrados em vermelho. Armadilha de velocidade de reposicionamento é mostrado para cada linha. Barras de escala verde correspondem a 5 mm em cada direcção.
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Discussion
Nós construímos um instrumento que combina duas armadilhas ópticas de tipos diferentes (Figura 1) para proporcionar facilidades de armadilhagem separadas para manipulação de objectos e de medição. A armadilha óptica "convencional" é construído em torno de 980 nm diodo laser. Este feixe é expandido, dirigidos e, em seguida, injectado no nosso microscópio invertido ("luz vermelha" feixe na Figura 1). A armadilha óptica holográfica é construído em torno de um laser de 1.064 nm DPSS. O feixe é ampliada para se ajustar ao tamanho do modulador de luz espacial (SLM), refletida na SLM a baixo ângulo de incidência, reduzido a encha um pouco a abertura de volta focal da objetiva, combinada com a linha de trapping "convencional" usando uma dicróica espelho e, finalmente, injectado no nosso microscópio ("vermelho escuro" feixe na Figura 1). Note-se que o SLM devem ser colocados num plano que é opticamente conjugar ao plano focal da objectiva.
No protocol seção, descrevemos as considerações de design e alinhamento que nos permitem minimizar a pegada espacial da instalação e ainda permitir a construção relativamente fácil. Descrevemos também o bloqueio do componente undiffracted produzido pelo SLM, o que pode ser necessário para um pacote comercial como o sistema utilizado aqui, mas é um pouco difícil e até hoje pouco documentada.
O projeto aqui descrito é altamente personalizável. Nós incluímos breves menções de várias personalizações populares de alto nível para armadilhas ópticas e como seria de integrar aqueles em nosso projeto. Por exemplo, uma única armadilha pode ser dirigido em várias formas, incluindo defletores acústico-óptica (AOD), defletores de eletro-ópticos (EOD) 12, móveis ou refletores deformáveis ou simplesmente rastering a lente direcção (L3 em nosso setup) 1. Do mesmo modo, a posição de um objecto preso pode ser determinada utilizando vários regimes e sensores. Em tais casos, a colocação típica e alinharmento dos componentes relevantes são descritos resumidamente. Esperamos que este trabalho possa fornecer um modelo para projetos mais complexos no futuro.
Várias considerações práticas e limitações de uso são de nota. Em primeiro lugar, as armadilhas ópticas não devem ser posicionados muito perto uns dos outros de modo a não interferir com os seus potenciais atraentes perto do centro armadilha. Se posicionamento próximo de duas armadilhas é necessário, então, é possível definir uma armadilha linha ligando os dois pontos de modo a que o potencial atractivo da armadilha se estende ao longo de toda a linha. Outro problema prático é que os objetos presos não pode ser movido tão rápido que eles experimentam arrasto hidrodinâmico excessiva (o limite exato depende da força armadilha), caso contrário o arrasto pode empurrar os objetos para fora da armadilha.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pela Universidade de Utah. Gostaríamos de agradecer ao Dr. J. Xu (UC Merced) e Dr. BJN Reddy (UC Irvine) para discussões úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical table | Newport corporation | ST-UT2-56-8 | Irvine, CA |
| Microscope, Inverted, Eclipse Ti | Nikon USA | MEA53220 | Melville, NY |
| Plan apo 100X oil objective (1.4 NA) | Nikon USA | MRD01901 | Melville, NY |
| Oil condenser Lens 1.4 NA | Nikon USA | MEL41410 | Melville, NY |
| EMCCD camera | Andor technology USA | Ixon DU897 | South Windsor, CT |
| 1/3" CCD IEEE1394 camera | NET USA Inc | Foculus FO124SC | Highland IN |
| Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength | Klastech Laser Technologies | Senza-1064-1000 | Dortmund; Germany |
| laser diode, TEM00, SLM, 980 nm | Axcel Photonics | BF-979-0300-P5A | Marlborough, MA |
| laser diode mount | ILX Lightwave | LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984 | Bozeman, MT |
| adjustable fiber ports | Thorlabs | PAF-X-11-B | Newton, NJ |
| holographic system | Arryx | HOTKIT-ADV-1064 | Chicago, IL |
| holographic mirror | Boulder Non-linear Systems | this is a part of HOTKIT-ADV-1064 | Lafayette, CO |
| Calcite polarizer | Thorlabs | GL10-B | Newton, NJ |
| half-wave plate | Thorlabs | WPH05M-1064 | Newton, NJ |
| Polarizer rotation mount | Thorlabs | PRM1 | Newton, NJ |
| half-wave plate rotation mount | Thorlabs | RSP1 | Newton, NJ |
| Shutter | Thorlabs | SH05 | Newton, NJ |
| dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI | Chroma Technology | t750spxrxt | Bellows Falls, VT |
| dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI | Thorlabs | DMSP1000R | Newton, NJ |
| custom mechanical adapter | Thorlabs | SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore | Newton, NJ |
| notch filter | Semrock | FF01-850/310-25 | Rochester, NY |
| Acousto-Optic deflector (2-axis) | intraAction | DTD-584CA28 | Bellwood, IL |
| goniometric stage | New Focus | 9081 | Santa Clara, CA |
| 60 mm steering lenses | Thorlabs | LA1134-B | Newton, NJ |
| 16 mm aspherical expander lens | Thorlabs | AC080-016-C | Newton, NJ |
| 175 mm expander lens | Thorlabs | LA1229-C | Newton, NJ |
| Spot blocker (cabron-steel sphere) | Bal-Tec | 0.0100" diameter | Los Angeles, CA |
| Microspheres (Carboxyl-polystyrene) | Spherotech | CP-45-10 | Lake Forest, IL |
References
- Svoboda, K., Block, S. M.
- Ashkin, A., Schutze, K., Dziedzic, J. M., Euteneuer, U., Schliwa, M. Force generation of organelle transport measured in vivo by an infrared laser trap. Nature. 348, 346-348 (1990).
- Shubeita, G. T., Tran, S. L., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Polin, M., Ladavac, K., Lee, S. H., Roichman, Y., Grier, D.
- Sun, B., Roichman, Y., Grier, D. G.
- Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C.
- Grier, D. G.
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Sheetz, M. P.
- Spudich, J. A., Rice, S. E., Rock, R. S., Purcell, T. J., Warrick, H. M. Optical traps to study properties of molecular motors. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1305-1318 (2011).
- Visscher, K., Gross, S. P., Block, S. M. Construction of multiple-beam optical traps with nanometer-resolution position sensing. Selected Topics in Quantum Electronics. IEEE Journal of. 2, 1066-1076 (1996).
- Valentine, M. T., Guydosh, N. R., et al. Precision steering of an optical trap by electro-optic deflection. Opt Lett. 33, 599-601 (2008).
