Bygging av en høyoppløselig mikroskop med konvensjonelle og Holografisk Optiske overlapping Capabilities

Summary

Systemet som er beskrevet heri benytter en tradisjonell optisk felle, så vel som en uavhengig holografisk optisk overtrykk linje, i stand til å skape og manipulere flere feller. Dette gir mulighet for etablering av komplekse geometriske arrangementer av refraktiv partikler samtidig tillater samtidige høy hastighet, høy oppløsning målinger av aktiviteten av biologiske enzymer.

Abstract

Høy oppløsning mikroskop systemer med optiske feller muliggjør presis manipulering av forskjellige refraktive objekter, slik som ^en dielektrisk perler eller cellulære organeller ^2,3, så vel som for høy romlig og tidsmessig oppløsning utlesing av deres stilling i forhold til midten av fellen. Systemet som er beskrevet her har en slik "tradisjonelle" felle som opererer ved 980 nm. Det gir i tillegg en andre optisk trapping system som bruker et holografisk kommersielt tilgjengelig pakke for samtidig å skape og manipulere komplekse mønstre fanging i synsfeltet av mikroskopet ^4,5 ved en bølgelengde på 1064 nm. Kombinasjonen av de to systemer gjør det mulig for manipulering av flere refraktiv objekter samtidig mens samtidig fører høy hastighet og høy oppløsning målinger av bevegelse og kraft ved produksjon nanometer og piconewton skala.

Introduction

Optisk fangst er en av de viktigste teknikkene i biofysikk ^seks. Et avgjørende fremskritt i optisk fangst har vært utviklingen av holografiske feller som gir mulighet for etablering av tredimensjonale fangst mønstre snarere enn konvensjonelle punkt feller ^7. Slike holografiske feller har fordelen av allsidighet i posisjonering av refraktiv stedene. Men konvensjonelle feller kan lett justeres til å være mer symmetrisk enn kommersielt tilgjengelige holografiske kits. De er også mulig for rask presis sporing av de fangede stedene. Her beskriver vi et system (Figur 1) som kombinerer de to fangstanleggene tilnærminger i ett instrument og tillater brukeren å utnytte fordelene av både som hensiktsmessig.

De generelle betraktninger for å konstruere optiske feller (basert på en enkelt eller flere laserstråler) er beskrevet i detalj et annet sted ^8-10. Her skisserer vi de hensyn som er spesifikke for s våretup og gi detalj av vår innretningsprosedyre. For eksempel er systemer med to optiske fangstmannstradisjoner bjelker beskrevet tidligere (ref. f.eks. ^11), typisk ved hjelp av en laserstråle for å fange en refraktiv objekt og ved hjelp av den andre (med hensikt lav effektstrålen) for dekoblet avlesning av posisjonen av objektet fanget . Her er imidlertid både laserstråler må være høy drevet (300 mW eller mer) fordi begge er som skal brukes for fangst. For målinger av biologiske systemer, bør lasere som brukes for fangst optimalt falle innenfor et bestemt NIR vindu av bølgelengde for å minimalisere lysindusert proteinnedbrytingen ^1.. Her har vi valgt å bruke 980 nm diode og 1064 nm dpss lasere på grunn av deres lave kostnader, høy tilgjengelighet og brukervennlighet.

Vi har også valgt å bruke en romlig lys modulator (SLM) å opprette og manipulere flere feller samtidig i sanntid ^4,5. Disse anordninger er kommersielt tilgjengeligemen deres integrering i et komplett oppsett gir unike utfordringer. Her beskriver vi en praktisk tilnærming som tar disse potensielle problemer og gir en svært allsidig instrument. Vi tilbyr et eksplisitt eksempel for den spesifikke oppsett beskrevet som kan brukes som en guide for modifiserte design.

Protocol

1. Installasjon av 980 nm bølgelengde enkelt optisk Trap

1. Optisk overtrykk på 980 nm bølgelengde er ofte optimal for biofysikk eksperimenter og billig laser dioder er lett tilgjengelig med effekt så høyt som 300 mW. Det er å foretrekke for en diodelaser som skal Pigtailed med polarisasjon-konserverende enkelmodusfiber med en kjent modus felt diameter. Fiberen må være lange nok til å fungere som et modusfilter og er vanligvis avsluttet med enten en FC / PC eller FC / APC-kontakt. Av disse er FC / APC foretrekke å minimere tilbake refleksjon av lys og potensielle tilbakemeldinger ustabiliteter.
2. Fest 980 nm laser diode i en mount som åpner for strøm og temperaturkontroll. Det er best å fikse mount til en optisk bordet rett å maksimere passiv varme synker og dermed minimere faren for diode svikt på grunn av en feil på temperaturregulator.
3. Monter PC / APC fiber-kontakt for strålen kollimasjonsoptikk. Det erkritisk for å sikre at den kollimerte strålen har minimal divergens så justerbare fiber-porter er mest anvendbare. Sørg for at den valgte fiber port matcher modus feltet diameter av dioden pigtail fiber. Hvis strålen skal rastered hjelp akustooptiske deflektorer (AOD), eller elektro-optiske deflektorer (EOD), vil den kollimert laserstråle midje må også være litt mindre enn størrelsen på deflektoren blenderåpning.
4. Fest collimating adapter til den optiske bord på tilstrekkelig avstand fra mikroskop for å tillate bjelke ruting, ekspansjon, og plassering av andre ønskede komponenter. Juster fiber port for å sikre konsekvent strålen midje over avstander sammenlignbare med generelle strålegangen til mikroskopet.
5. Installer speil er angitt i figur 1.. Fjern målet fra mikroskopet og bruk av speilene for å dirigere strålen gjennom åpningen i den objektive montering stadium. Hvis foretrukket, kan plassering av dichroic speil DM1 og DM3 utelates førsenere. DM2 og DM3 er både shortpass og overføre synlig lys mens reflektere nær IR og oppover.
6. Det er nyttig å midlertidig feste en laserpekare i stedet for objektiv, innrettes på den optiske akse av mikroskopet. En tilpasset mekanisk adapter er nødvendig for å sikre sentrering av laser-pekeren. Synlig strålen fra laseren pekeren kan deretter føres tilbake til midten av åpningen av fiber-port og kan deretter brukes til å montere linsene (se nedenfor).
7. Installer 980 nm bjelke ekspander (L8 og L9) på en riktig avstand fra fiber port for å tillate fremtidige innsetting av styrekomponentene (AOD eller EOD) som nødvendig ^en. Den utvidede strålen må litt overfylle tilbake brennvidde blenderåpning på målet. (Her objektiver med brennvidde på 125 mm og 60 mm er i en Keplerian ordning til omtrent det dobbelte strålen midjen). Bruk synlig laserpeker strålen (se punkt 1.6) for å sikre riktig objektiv plassering og grov justering.
8. Install de 980 nm styring linser (L2 og L3) i et teleskop ordning som indikert (her har begge 60 mm brennvidde) ^1. L3 er montert i et plan konjugert til den tilbake-fokalplanet til objektivet. Mount L3 på en presisjon XYZ posisjonering scenen for å tillate beam styring. Det er nyttig for XYZ scenen for å ha digitale indikatorer for sine mikrometer, noe som åpner for repeterbare posisjonering og reposisjonering av fellen. Den 0.5 "utvalg av reiser er vanligvis tilstrekkelig, kan imidlertid lengre reise for L3 posisjonering langs den optiske aksen være nyttig. Bruk synlig laserpeker strålen (se punkt 1.6) for å sikre riktig objektiv plassering og grov justering.

2. Installasjon av Laser Detector

1. Installasjon av dikroiske speil DM3 over kondensatoren som vist på figur 1. En tilpasset mount er vanligvis nødvendig. Sikre kvadrant fotodiode (QPD) eller en posisjonssensitiv detektor (PSD) ⁸ til den side av kondensatoren montering og ENSure at 980 nm laserstrålen reflekteres av DM3 er å treffe det omtrent på midten. Ved bruk QPD, sørge for at den er montert på en liten XY stadium for å tillate nøyaktig sentrering av føleren på laserstrålen.
2. Installer L1 (vanligvis en 30 mm linse) mellom dm3 og sensoren. Posisjon L1, slik som å fokusere strålen til en enkelt flekk på sensoren.
3. Installer hakk filter like før L1 for å blokkere 1064 nm strålen samt noen streif synlige lysrefleksjoner fra mikroskopet lyset og ambient belysning.

3. Installasjon av 1064 nm bølgelengde Holografisk Trap

1. Holografiske del av oppsettet er bygget rundt et kommersielt tilgjengelig hardware / software pakke den holografiske speil som brukes i denne pakken er klassifisert for en maksimal hendelsen kraft 5 eller 10 W / cm ^2. Single mode TEM00 bjelker i dette effektområdet kan enkelt hentet fra en DPSS laser på 1064 nm bølgelengde.
2. Monter 1064 nm laser på en opphøydplattform til omtrent samme høyde som strålebanen for linje 980 (se kapittel 1).
3. Hvis ikke direkte kontrollerbar, kan laser makt justeres manuelt ved å installere en halv bølge plate (HWP) og et polarisasjonsfilter (PBS) rett etter laser utgang blenderåpning. Det er nyttig å montere polarisatoren i en roterende stadium å kunne passe holografiske speilet krav for strålen polarisering.
4. Installer 1064 nm bjelke ekspander (L6 og L7). Laserstrålen midje må utvides for å passe den diagonale størrelsen av den holografiske speilet. For store utvidelse forholdstall (10X ovenfor) kan det være et problem å holde størrelsen av ekspanderen liten. Dermed kan det være ønskelig å bruke objektiver med usedvanlig liten brennvidde (her: 16 mm og 175 mm).
5. Installer de andre speil som indikert å dirigere 1064 nm strålen gjennom målet.
   1. Secure DM1 dichroic (45 ° innfallsvinkel) i en kinematisk montere og plassere monteringen i 980 nm strålen banen slik at det gir mulighet for undiminished overføring av at strålen.
   2. Aktiver laserpeker lys. Den DM1 speil bør gjenspeile tilstrekkelig mengde av synlig lys plasseres riktig romlig lys modulator (SLM) i veien for denne bjelken. SLM må også være vinklet slik at innkommende og utgående laserstråler er så nært som mulig til vanlig forekomst. Imidlertid innfallsvinkelen må være tilstrekkelig stor for å sikre at laserstrålen ikke er klippet av objektivfatninger og andre optiske komponenter. En 5 ° vinkel bør være lett oppnåelige og er tilstrekkelig liten. Endelig avstand fra DM1 til SLM må måles nøyaktig, slik at innsetting av linsene L4 og L5 (se 3.6 nedenfor) kan bøye den SLM speil flyet og back-fokusplan av målet.
   3. Installere et speil for å styre lyset fra 1064 nm bjelke ekspander til SLM. Kontroller at laserpeker lyset treffer strålen ekspander blenderåpning på senteret.
6. Installer linser L4 og L5 (her: objektiver med 125 mm og 200 mm henholdsvis). Dette teleskopet pair konjugater SLM speil flyet til baksiden fokusplan på objektivet og også reduserer strålen midjen til bare litt overfylle baksiden blenderåpning på objektivet. Vi valgte objektiver med lange brennvidder til verdensrommet SLM unna DM1. Dette ikke bare tømmer rom for andre laserlinjen men også tendens til å gjøre justeringen lettere.
7. Fjern laserpekeren. Forlate montering adapter for å fungere som grov justering blenderåpning.

4. Installasjon og oppretting Merknader

1. Linse L3 og SLM må plasseres slik at den er optisk konjugert til den bakre fokalplan målet. Den felles midtpunkt i L4 og L5 er optisk konjugert til prøven flyet hvis de optiske fangstmannstradisjoner bjelker som injiseres i uendelig plass av mikroskopet.
2. synge IR-kort viewer justere 980 nm strålen å gå langs midtaksen av åpningen i laserpeker adapter.
3. Bruk IR-kort to sikre at 1064 nm strålen treffer samme sted som den 980 nm strålen på DM1, L2 og L3, og at 1064 nm strålen går langs senteraksen til hullet i laser pekeren adapteren.
4. Bytt laserpekeren montering adapter med et mål. Høy numerisk apertur olje eller vann Målet er typisk.
5. Juster 980 nm felle som beskrevet i ⁹ ved "walking" av laserstrålen i inntil en radielt symmetrisk interferensmønster er sett på kameraet.
6. Med den holografiske speil av (dvs. opptrer som en passiv speil) bruke SLM og DM1 å "gå" den undiffracted 1064 nm strålen å justere 1064 nm trap.
7. SLM produserer en betydelig undiffracted bjelke som resulterer i en sterk unmovable laser felle i synsfeltet. Dette er nyttig for innretting, men kan være uønsket for eksperimenter. Hvis du vil blokkere denne fellen man kan sette inn et lite ugjennomsiktig objekt i veien for undiffracted lys på stedet konjugat til prøven fly (f.eks the felles samlingspunkt i L4 og L5). Størrelsen på dette sentrale sted stopperen må være noe større enn diameteren på Airy disken for fokusert lys (en blokkering med 100-300 mikrometer diameter for det system som er beskrevet).
8. djust 1064 nm strålen polarisering bruker polarizer å matche SLM orientering. Roter halvbølge plate å sette utgangseffekt på strålen som ønsket.
9. Hvis ønskelig, sett AOD eller EOD beam styring elementer inn i 980 nm laser linje. Sikre riktig konjugering av disse elementene til back-fokusplan på objektivet og re-align fellen. Det er nyttig å montere styring elementer på en goniometric scenen.

Representative Results

Den monterte oppsettet gjør at føreren kan felle flere refraktiv gjenstander i sanntid og plassere dem i alle tre dimensjoner innenfor synsfeltet. Vi illustrerer de holografiske egenskapene til instrumentet ved å fange 11 mikrosfærer (figur 2). Fellen avgrense hvert objekt manuelt gjenposisjonert ved overlapping slik at det endelige ordningen viser logoen til University of Utah der dette eksperimentet ble utført. En kombinert funksjon av holografiske og konvensjonelle felle er vist i figur 3.. Den konvensjonelle felle beveger sentral vulsten progressivt raskere ved (felle hastigheter på 1,3, 10 og 82 um / sek er vist), mens holographically definerte feller forbli stasjonær. På høyeste hastighet, skjer hele bevegelsen av perlen under innspillingen av en ramme av video og dermed fremstår som ekstrem bevegelsesuskarphet. Det er mulig å flytte den konvensjonelle felle raskt nok til at perler blir tvunget bort fra fangst potensial ved hydrodynamic dra (ikke vist).

Merk at sammenstillingen av komplekse former som benytter multiple mikrokuler kan føre til et tilfelle hvor antall mikrokuler i synsfeltet er utilstrekkelig for fullstendig sammenstilling (som er tydelig i figur 2). I slike tilfeller må operatøren fysisk beveger synsfelt i forhold til prøven (dvs. reposisjonere prøven stadium i mikroskop) å eksponere flere mikrosfærer samtidig beholde de objekter som allerede er fanget.

Figur 1. Skjematisk av høyoppløselig mikroskop system med to fangst bjelker. Komponenter merket L1-L9 er grunnleggende linser. Bestanddeler merket DM1-DM3 er dichroic speil. Linser L2 og L3 er brukt til styring. Objektiver L4 og L5 fungere som en beam redusering og spacer. Objektiver L6/L7 og L8/L9 er bjelke ekspander par for sine respektive laserstråler. Umerkede komponenter avbildet som solide svarte firkanter er grunnleggende speil. Bestanddeler merket MC og MO er mikroskop kondensator og objekt, henholdsvis. Andre komponenter er en quad foto diode (QPD), hakk filter (NF), Peltier temperaturregulator scenen (PTC), hot filter (HF), romlig lys modulator (SLM), akustooptiske deflektor (AOD), skodder (S1 og S2), halv-wave plate (HWP) og polariserende strålesplitter (PBS).

Figur 2. En romlig ordning representerer en University of Utah logo er laget ved hjelp av 11 operatøren definert og kontrollert holografiske feller. Objektene fanget er refraktiv perler (se tabell of Materials for mer detaivs) suspendert i avionisert vann. Røde og grønne sirkler viser felle stillinger. Rammer (a) - (f) representerer suksessive stadier i logo konstruksjon.

Figur 3. To rader av fellene er laget ved å anvende 6 operatør definert og kontrollert holografiske feller. Ytterligere konvensjonelle felle er definert mellom de to rader og dens posisjon blir justert ved forskjellige hastigheter som angitt. Perlen er flyttet til en maksimal romlig forskyvning av 4,1 mikrometer og deretter tilbake til den opprinnelige plasseringen. En video av perle bevegelse er registrert på 47 fps. Som felle reposisjonering hastigheten økes, blir gradvis større bevegelsesuskarphet observert i videoen. Objektene fanget er refraktiv perler (se tabell over Materialer for mer informasjon) suspendert i de-ionisert vann. Frame timings er vist i rødt. Felle reposisjonering hastighet vises for hver rad. Grønne skala barer samsvarer med 5 mikrometer i hver retning.

Discussion

Vi har konstruert et instrument som kombinerer to optiske feller av forskjellige typer (figur 1) for å tilveiebringe separate anlegg for oppfanging objekt manipulasjon og måling. Den "vanlige" optisk felle er bygget rundt en 980 nm diode laser. Denne bjelke er utvidet, styrt og deretter injisert i vår invertert mikroskop ("lys rød" bjelke i figur 1). Holografiske optisk fellen er bygget rundt en 1064 nm DPSS laser. Bjelken er utvidet for å passe størrelsen av romlig lysmodulator (SLM), reflekteres av SLM ved lav innfallsvinkel, redusert til litt overfylle tilbake fokal aperturen til objektivet, kombinert med den "konvensjonelle" trapping linje ved hjelp av en dikroisk speil, og til slutt injisert i mikroskopet vår ("dark red" bjelke i figur 1). Legg merke til at SLM må plasseres i et plan som er konjugere optisk til den bakre fokalplan målet.

I protocol delen beskriver vi design og justering hensyn som tillater oss å minimere romlig fotavtrykk av oppsett og fremdeles aktivere relativt enkel konstruksjon. Vi beskriver også blokkering av den undiffracted komponent fremstilt ved SLM, som kan være nødvendige for en kommersiell pakning som det system som brukes her, men er noe krevende og hittil dårlig dokumentert.

Utformingen er beskrevet her er svært lett å tilpasse. Vi har tatt med kort nevner av flere populære høyt nivå tilpasninger for optiske feller og hvordan man ville integrere dem inn i vårt design. For eksempel kan en enkelt felle styres på flere måter, blant annet akustooptiske avvisere (AOD), elektrooptiske avvisere (EOD) ^12, bevegelige eller deformerbare reflektorer eller bare rastering styringsgruppen objektivet (L3 i oppsettet vår) ^en. Likeledes kan posisjonen til et objekt fanget bestemmes ved anvendelse av mange ordninger og sensorer. I slike tilfeller, typisk plassering og justerling av relevante komponenter er kort beskrevet. Vi forventer at dette arbeidet kan gi en mal for mer komplekse konstruksjoner i fremtiden.

Flere praktiske hensyn og bruk begrensninger er av notatet. Først skal de optiske feller ikke plasseres for nær hverandre for ikke å interferere med sine tiltalende potensialer nær felle sentrum. Dersom nær plassering av to feller er nødvendig, så er det mulig å definere en linje felle som forbinder de to punkter, slik at den attraktive potensialet av fellen strekker seg langs hele linjen. En annen praktisk problem er at de fangede objekter ikke kan flyttes så fort at de opplever overdreven hydrodynamisk drag (nøyaktig terskel avhenger felle styrke) ellers drag kan skyve objektene ut av fellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (cabron-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL