Het nut van Stage-specifieke mid-to-late<em> Drosophila</em> Follikel Isolation
Summary
Stage-specifieke isolatie van midden tot late Drosophila follikels is bruikbaar voor verschillende doeleinden. Deze follikels ontwikkelen cultuur, die zorgt voor genetische en / of farmacologische manipulaties worden gecombineerd met in vitro assays en levende ontwikkeling beeldvorming. Bovendien kan follikels worden gebruikt voor moleculaire studies, zoals het isoleren van mRNA en eiwit.
Abstract
Drosophila oögenese of follikel ontwikkeling is op grote schaal gebruikt om het begrip van complexe ontwikkelings-en cel biologische processen te bevorderen. Deze methoden paper beschrijft hoe mid-to-late stadium follikels (Stage 10B-14) te isoleren en ze gebruiken om nieuwe inzichten in de moleculaire en morfologische gebeurtenissen tijdens strakke ramen van ontwikkelingstijd. Geïsoleerde follikels kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van experimentele technieken, zoals in vitro ontwikkeling testen levende beeldvorming mRNA expressie analyse en Western blot analyse van eiwitten. Follikels 10b (S10B) of later voltooiing ervan in cultuur, dit maakt het mogelijk om genetische of farmacologische verstoringen combineren met in vitro ontwikkeling ten gevolgen van deze manipulaties op de processen die optreden tijdens bepaalde perioden van ontwikkeling definiëren. Bovendien, omdat deze follikels zich in kweek, ze zijn ideaal voor levende weergavestudies, Die vaak onthullen nieuwe mechanismen die morfologische gebeurtenissen bemiddelen. Geïsoleerde follikels kan ook worden gebruikt voor moleculaire analyse. Zo kunnen veranderingen in genexpressie als gevolg van genetische storingen worden gedefinieerd voor specifieke ontwikkelingsstoornissen ramen. Daarnaast kunnen eiwit niveau, stabiliteit en / of posttranslationele modificatie toestand tijdens een bepaald stadium van de follikelontwikkeling onderzocht door western blot analyses. Aldus stadium-specifieke isolatie van Drosophila follikels geeft een rijke bron van informatie in sterk geconserveerde ontwikkelingsprocessen en morfogenese.
Introduction
Elke Drosophila eierstok bestaat uit ~ 16 ovarioles of ketens van opeenvolgend rijpende ei kamers of follikels. Elke follikel bestaat uit een oöcyt, 15 kiemlijn afkomstig verpleegkundige of steuncellen en ~ 650 somatische cellen genoemd follikel cellen (Figuur 1A). Drosophila oögenese bestaat uit 14 morfologisch gedefinieerde stadia van ontwikkeling 1. Elke fase van de follikelontwikkeling wordt vaak waargenomen binnen een vlieg, waardoor het relatief eenvoudig om een groot aantal fasespecifieke follikels isoleren.
De mid-to-late stadia van oögenese (Etappes 10B-14) zijn bijzonder goed geschikt voor fase isolatie (figuur 1). In fase 10B (S10B), wordt de follikel volledig verlengd (dat wil zeggen de lengte gelijk is aan die van fase 14 (S14) follikel, zie figuur 1 en figuur 2H) en de halve lengte van de follikel bestaat uit cellen nurseterwijl de andere helft de eicel (figuur 1C). In dit stadium van de verpleegkundige cellen ondergaan dramatische actine verbouwing, het versterken van de corticale actine en het genereren van parallelle bundels van actine filamenten 2. Tegelijkertijd, een populatie van follikel cellen genoemd centripetale cellen migreren tussen de verpleegkundige cellen en de eicel en twee dorsale groepen follikel cellen bepaalde migratie ondergaan om de dorsale aanhangsels buisvormige respiratoire inrichtingen voor het embryo 3 vormen . De verpleegkundige cellen vervolgens contract (S11), knijpen hun cytoplasmatische inhoud in de eicel in een proces genaamd verpleegster cel dumping, die de eicel voorziet van de benodigde factoren voor het naar embryogenese (figuur 1D) te voltooien. De verpleegkundige cellen ondergaan dan celdood (S12-S13) 4, en de follikel cellen scheiden en het patroon van de eierschaal 5 (figuren 1E-G). Aldus eind oögenese is rijk aan een belangrijke ontwikkelingd morfogenetische processen.
Geïsoleerde midden tot late stadium follikels (S10B-S14) kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, waaronder moleculaire analyses. Bijvoorbeeld kan mRNA uit opgevoerd follikels worden geïsoleerd voor RT-PCR, microarray of RNA-seq analyses. Hierdoor kan men kijken genexpressie binnen een kort tijdsinterval ontwikkeling, met slechts enkele celtypen aanwezig, en bepalen hoe genexpressie wordt veranderd door een farmacologische of genetische verstoringen. Isolatie fase kan ook worden gebruikt om te kijken naar eiwitten door Western blotting. Dergelijke analyse is belangrijk omdat het toelaat om het niveau van eiwitexpressie te kwantificeren in wildtype versus mutanten in specifieke fasen. Terwijl men zou kunnen gebruiken immunofluorescentie analyses vergelijkbare resultaten, kwantificering van fluorescentie minder robuust door de strenge eisen dat alle pixels in het lineaire detectiegebied 6. Bovendien kan western blot analyse andere gegevens, zoals eenen indien het proteïne posttranslationeel wordt gewijzigd of wordt tot expressie gebracht vanaf een bepaalde verbinding isovorm. Geïsoleerde fasen kan ook gebruikt worden voor verdere eiwitzuivering, zoals subcellulaire fractionering of co-immunoprecipitatie.
Fasespecifieke follikel isolatie kan ook worden gebruikt voor in vitro ontwikkeling assays 7 en live imaging 8. Geïsoleerde S10B-S13 follikels zal blijven ontwikkelen tot S14 in eenvoudige cultuur media (zie hieronder). Het is belangrijk op te merken dat S10A follikels niet verder komt verpleegkundige cel dumpen met behulp van de kweekomstandigheden besproken in dit manuscript. We hebben S10B in vitro ontwikkeling assays gebruikt om de rol van prostaglandines definiëren, zowel farmacologisch en genetisch, reguleren actine remodeling met verpleegkundige cel dumping en ontwikkeling uitlezingen 7,9. Evenzo kan de latere ontwikkelingsstadia ook worden geïsoleerd om de effecten van farmacologische behandelingen of genetische mens bepalenipulations op specifieke processen zoals middelpuntzoekende cel migratie, dorsale aanhangsel migratie / vorming 10, en verpleegkundige celdood. Dergelijke testen kunnen worden gebruikt om dominante interactie schermen of assays te voeren, bijvoorbeeld, terwijl heterozygotie voor mutaties in pxt of fascin alleen hebben geen effect op S10B in vitro ontwikkeling, follikels van dubbele heterozygoten vertonen verpleegkundige cel dumpen gebreken en een blok in ontwikkeling 9.
Bovendien, omdat S10B-13 kunnen ontwikkelen in kweek, alle processen die optreden tijdens deze tijd worden waargenomen live-beeldvorming. Dergelijke beeldvorming kan gebeuren door simpelweg met behulp van doorvallend licht (als men in de bruto veranderingen in morfologie alleen geïnteresseerd) of met confocale microscopie met behulp van transgene vliegen uiten fluorescerende probes of follikels gekleurd met live-imaging kleurstoffen. Live-beeldvorming wordt gebruikt om ons begrip van ontwikkelingsprocessen aanzienlijk vooruit. Inderdaad, wonen imaging laat stadium follikels heeft uitgebreid de kennis van dorsale aanhangsel migratie, een voorbeeld van tubulogenesis 10. We verwachten dat levende beeldvorming van extra laat stadium processen, waaronder actine dynamiek tijdens verpleegster cel dumping, nieuwe inzichten zal geven in deze ontwikkeling gebeurtenissen. Het is belangrijk op te merken dat terwijl S10A en vroege stadia van de ontwikkeling van de follikel niet zal blijven ontwikkelen tot een S14 in cultuur, live beeldvorming van gebeurtenissen tijdens de fasen van ontwikkeling is mogelijk met behulp van alternatieve kweekomstandigheden 11-14 (zie Overleg voor meer informatie).
Hier bieden wij gedetailleerde protocollen voor het isoleren laat stadium follikels voor zowel in vitro ontwikkeling en live-imaging, of moleculaire analyses (mRNA en eiwit isolatie).
Protocol
Representative Results
Discussion
De Drosophila follikel bestaat uit slechts een klein aantal celtypen, waardoor het ideaal is voor zowel morfologische en moleculaire analyses. Bovendien, door de structuur van de eierstok, is het relatief eenvoudig om grote aantallen specifieke stadia van de follikelontwikkeling te verkrijgen met een gemeenschappelijke ontleden reikwijdte en minimale training. Elke fase is een korte temporele venster kunt stadium isolatie significante moleculaire inzichten in de ontwikkelingsprocessen die tijdens die fase biede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Thomas Lecuit (SQH-Utrophin :: GFP lijn), de Bloomington Stock Center en de Developmental Studies Hybridoma Bank bedanken voor reagentia. Wij bedanken verder alle leden van de Tootle Lab voor nuttige discussies en kritieken van het manuscript. De financiering van de National Science Foundation MCB-1158527, en start-up middelen van de afdeling Anatomie en Celbiologie van de Universiteit van Iowa dit werk ondersteund. National Institutes of Health predoctorale Training Grant in Farmacologische Wetenschappen T32GM067795 ondersteund AJS. Gegevensopslag ondersteuning werd verleend door de ICTS, dat wordt gefinancierd door de CTSA ondersteund door het National Center for Research Resources en het National Center for Translational Voortschrijdende Sciences, National Institutes of Health, door Grant UL1RR024979.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
References
- Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
