O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final<em> Drosophila</em> Folículo Isolamento
Summary
Isolamento específico do estágio de médio a tarde folículos de Drosophila é útil para uma variedade de fins. Esses folículos se desenvolvem na cultura, o que permite manipulações genéticas e / ou farmacológicos a ser, juntamente com ensaios in vitro de desenvolvimento e de imagem ao vivo. Adicionalmente, os folículos pode ser utilizado para estudos moleculares, tais como isolamento de ARNm e proteína.
Abstract
Drosophila oogenesis ou desenvolvimento folicular tem sido amplamente utilizada para fazer avançar a compreensão dos processos biológicos de desenvolvimento e celulares complexos. Este artigo descreve métodos de como isolar folículos estágio médio a tardio (Stage 10B-14) e utilizá-los para fornecer novos insights sobre os eventos moleculares e morfológicas que ocorrem durante as janelas apertados de tempo de desenvolvimento. Os folículos isolados podem ser utilizados para uma variedade de técnicas experimentais, incluindo ensaios in vitro de desenvolvimento, imagens em tempo real, a análise da expressão de mRNA e análise de Western blot de proteínas. Os folículos em estágio 10B (S10B) ou mais tarde vai completar o desenvolvimento da cultura, o que permite combinar perturbações genéticas ou farmacológicas com o desenvolvimento in vitro para definir os efeitos de tais manipulações sobre os processos que ocorrem durante períodos específicos do desenvolvimento. Além disso, porque estes folículos desenvolver-se em cultura, eles são idealmente apropriados para estudos de imagiologia em directo, Que muitas vezes revelar novos mecanismos que medeiam eventos morfológicos. Os folículos isolados também podem ser usadas para análises moleculares. Por exemplo, as alterações na expressão de genes que resultam de perturbações genéticas pode ser definido para janelas de desenvolvimento específicos. Além disso, o nível de proteína, estabilidade e / ou pós-tradução estado modificação durante um estágio específico do desenvolvimento folicular pode ser examinado através de western blot analisa. Assim, o isolamento específico do estágio de folículos Drosophila fornece uma rica fonte de informações em processos amplamente conservadas do desenvolvimento e morfogênese.
Introduction
Cada ovário Drosophila é composto de ~ 16 ovaríolos, ou cadeias de sequencialmente amadurecimento câmaras de ovos ou folículos. Cada folículo é composta por um único oócito, células derivadas de enfermagem ou de suporte 15 da linha germinal, e ~ 650 células somáticas denominadas células foliculares (Figura 1A). Drosophila oogénese é dividido em 14 etapas morfologicamente definidas de desenvolvimento 1. Cada fase de desenvolvimento folicular é observado muitas vezes dentro de um único mosca, tornando relativamente fácil de isolar um número substancial dos folículos específica da fase.
Os meio-de-final etapas da ovogênese (Stages 10B-14) são particularmente adequados para o isolamento de fase (Figura 1). Na Fase 10B (S10B), o folículo é totalmente alongada (isto é, o seu comprimento é igual à de uma Fase 14 (S14) folículo, ver Figura 1 e Figura 2H) e metade do comprimento do folículo é composto de células enfermeiraenquanto que a outra metade é o ovócito (Figura 1C). Nesta fase, as células passam por enfermeira dramática remodelação da actina, o reforço da actina cortical e gerar feixes paralelos de dois filamentos de actina. Ao mesmo tempo, uma população de células foliculares, chamadas de células centrípetas, migram entre as células e a enfermeira de oócitos, e dois grupos dorsais de células foliculares de tornar especificado para sofrer a migração para formar os apêndices dorsais, aparelhos respiratórios tubulares para o embrião 3 . As células de enfermagem, em seguida, contrato (S11), apertando seu conteúdo citoplasmático para o oócito em um processo chamado de célula enfermeira dumping, que fornece o oócito com os fatores necessários para a conclusão da embriogênese (Figura 1D). As células, em seguida, submetidos a enfermeira morte celular (S12-S13) 4, e as células do folículo e secretar padrão da casca de ovo 5 (Figuras 1E-G). Assim, o fim do oogenesis é rico com um desenvolvimento importanted processos morfogenéticos.
Folículos isolados fase meio-de-final (S10B-S14) pode ser usado para uma variedade de fins, incluindo as análises moleculares. Por exemplo, o ARNm a partir de folículos encenadas pode ser isolado por RT-PCR, de microarray, ou análise de RNA-seq. Isto permite que se olhe para a expressão de genes dentro de uma janela de desenvolvimento curto, com apenas alguns tipos de células presentes, e determinar a expressão de genes é alterada por perturbações ou farmacológicas ou genéticas. Isolamento fase também pode ser usado para examinar as proteínas por transferência Western. Tal análise é importante porque ela permite quantificar o nível de expressão da proteína de tipo selvagem em relação mutantes em fases específicas. Apesar de se poder utilizar análises de imunofluorescência para conseguir resultados semelhantes, a quantificação de fluorescência é menos robusta, devido aos requisitos estritos que todos os pixels dentro da gama linear de detecção 6. Além disso, a análise de Western blot pode fornecer outras informações, tals, se a proteína for modificada posttranslationally ou é expressa a partir de uma isoforma específica de splicing. Isolado fases também pode ser utilizado para purificação de proteína, incluindo o fraccionamento subcelular ou coimmunoprecipitation.
Isolamento folículo específico-Stage também pode ser usado para ensaios in vitro de desenvolvimento 7 e live-imaging 8. Isolados folículos S10B-S13 continuará a desenvolver a S14 em meios de cultura simples (veja abaixo). É importante notar que os folículos S10A não vai progredir através célula enfermeira despejo usando as condições de cultura discutidas no texto. Temos usado S10B ensaios in vitro de desenvolvimento para definir o papel das prostaglandinas, tanto farmacologicamente e geneticamente, ao regular a remodelação actina utilizando células enfermeira dumping e desenvolvimento como ler-outs 7,9. Do mesmo modo, as fases posteriores do desenvolvimento, também pode ser isolado para determinar os efeitos de tratamentos farmacológicos ou homem genéticaipulations sobre processos específicos, como a migração centrípeta celular, migração apêndice dorsal / formação 10, e morte celular enfermeira. Tais ensaios podem ser utilizados para realizar telas de interacção dominantes ou ensaios, por exemplo, enquanto a heterozigosidade para mutações em pxt ou fascina sozinho não tem nenhum efeito sobre o desenvolvimento in vitro S10B, os folículos de heterozigotos duplas célula enfermeira exposição de dumping defeitos e um bloco em desenvolvimento 9.
Além disso, porque S10B-13 pode desenvolver-se em cultura, todos os processos que ocorrem durante este tempo pode ser observada por formação de imagens em directo. Essa imagem pode ser realizado simplesmente usando luz transmitida (se estiver interessado apenas em alterações macroscópicas na morfologia) ou com a microscopia confocal usando moscas transgênicos expressando sondas fluorescentes ou folículos corados com corantes de imagem ao vivo. Imagens ao vivo está sendo usado para fazer avançar substancialmente a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento. De fato, imagin viverg de folículos fase tardia ampliou o conhecimento da migração apêndice dorsal, um exemplo de tubulogenesis 10. Esperamos que a imagem ao vivo de processos fase tardia adicionais, incluindo dinâmica de actina durante celular enfermeira dumping, vai fornecer novos insights sobre esses eventos de desenvolvimento. É importante notar que, enquanto S10A e estágios iniciais de desenvolvimento do folículo não vai continuar a evoluir para uma S14 na cultura, live-imagem dos eventos que ocorrem durante os estágios de desenvolvimento é possível, utilizando condições de cultura alternativos 11-14 (ver discussão mais informação).
Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar folículos fase tardia para qualquer desenvolvimento in vitro e live-imagem, ou análises moleculares (mRNA e isolamento de proteínas).
Protocol
Representative Results
Discussion
O folículo Drosophila é composto de apenas um pequeno número de tipos de células, tornando-o ideal para ambos morfológica e análises moleculares. Além disso, devido à estrutura do ovário, é relativamente fácil de obter um grande número de fases específicas do desenvolvimento folicular com um escopo de dissecação comum e uma formação mínima. À medida que cada estágio representa uma janela temporal, curto, isolamento fase pode fornecer informações moleculares significativas nos processos de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: linha GFP), o Bloomington Stock Center, ea Developmental Studies Hybridoma Banco de reagentes. Agradecemos ainda todos os membros do Laboratório Tootle para discussões úteis e críticas do manuscrito. O financiamento da National Science Foundation MCB-1158527, e fundos de arranque da Anatomia e Departamento de Biologia Celular da Universidade de Iowa apoiaram este trabalho. National Institutes of Health Predoctoral Training Grant em Ciências Farmacológicas T32GM067795 apoiado AJS. Suporte de armazenamento de dados foi fornecido pela ICTS, que é financiado através do CTSA apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Institutos Nacionais de Saúde, através Grant UL1RR024979.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
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