Of Utility Sahne özgü Orta-geç<em> Drosophila</em> Folikül İzolasyon
Summary
Orta-geç Drosophila köklerinin Aşama özgü izolasyon çeşitli amaçlar için yararlıdır. Bu tür foliküllerin gelişmesi in vitro tahliller ve canlı görüntüleme ile bağlanmak üzere genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlara olanak sağlar kültür gelişir. Buna ek olarak, bu tür folikül mRNA ve protein izole gibi moleküler genetik araştırmaları için kullanılabilir.
Abstract
Drosophila oogenez veya folikül gelişimi yaygın olarak karmaşık bir gelişimsel ve hücre biyolojik süreçlerin anlayışı ilerletmek için kullanılır olmuştur. Bu yöntemler kağıt orta-geç evre foliküllerini (Sahne 10B-14) izole ve gelişimsel zaman sıkı pencere sırasında meydana gelen moleküler ve morfolojik olaylara yeni bakış açıları sağlamak için bunları kullanmak için nasıl açıklar. İzole folikül gelişimi in vitro tahlilleri, canlı görüntüleme, mRNA ifade analizi ve proteinlerin western blot analizi de dahil olmak üzere deneysel teknikler, çeşitli için kullanılabilir. Sahne 10B (S10B) ya da daha sonra folikülleri kültür gelişimini tamamlayacak, bu bir gelişme belirli dönemlerinde ortaya çıkan süreçler üzerinde bu tür manipülasyonlar etkilerini tanımlamak için in vitro gelişimi ile genetik veya farmakolojik tedirginlikler birleştirmek sağlar. Bu folikülleri kültür gelişir çünkü Ayrıca, onlar ideal canlı görüntüleme çalışmaları için uygundur, Genellikle morfolojik olaylara aracılık yeni mekanizmalar ortaya hangi. İzole köklerinin aynı zamanda moleküler analiz için kullanılabilir. Örneğin, genetik düzensizliklerin neden gen ekspresyonunda değişiklikler belirli bir gelişimsel pencereler için tanımlanabilir. Ayrıca, folikül gelişiminin belirli bir aşamasında protein düzeyi, kararlılık, ve / veya sonrası tadilat devlet western blot ile analiz incelenebilir. Böylece, Drosophila köklerinin sahne özel izolasyon gelişimi ve morfojenezinin yaygın korunmuş süreçlerine zengin bir bilgi kaynağı sağlar.
Introduction
Her bir Drosophila yumurtalık 16 ovarioles, ya da sıralı olarak olgunlaşma yumurta odalar veya folikül zincirlerinin ~ oluşmaktadır. Her folikül tek oosit, 15 germ hattı türetilmiş hemşire veya destek hücreleri ve folikül hücreleri (Şekil 1A) olarak adlandırılan ~ 650 somatik hücrelerden oluşmuştur. Drosophila oogenez 1 geliştirme 14 morfolojik olarak tanımlanmış aşamaları ayrılmıştır. Folikül gelişiminin her aşaması nispeten kolay sahne özgü folikül önemli sayıda izole etmek için yapım, bir tek sinek içinde birçok kez görülmektedir.
Oogenezisin (10B-14 Aşamaları) orta-geç aşamaları (Şekil 1) evre izolasyonu için özellikle uygundur. Aşama 10B (S10B) olarak, folikül tamamen (yani, uzunluğu, bir evre 14 (S14) folikül eşit olan, Şekil 1 ve Şekil 2H bakınız) uzatılmış ve folikül yarısı uzunluğu hemşire hücrelerden oluşmaktadırdiğer yarısı oosit (Şekil 1C) iken. Bu aşamada hücreler, hemşire kortikal aktin güçlendirilmesi ve aktin ipliklerin 2 paralel demetleri üreten, dramatik aktin yeniden geçer. Aynı zamanda, folikül hücreler popülasyonu, hemşire hücreleri, ve oosit arasında geçiş, merkezcil hücreleri olarak adlandırılan ve folikül hücrelerin iki dorsal grup dorsal uzantıları, embriyo 3 için boru şekilli solunum cihazları meydana göç geçmesi için belirtilen olmak . Hemşire bu embriyojenezinin (Şekil 1D) tamamlamak için gerekli faktörleri ile oosit sağlar hemşire hücre damping denilen bir süreç içinde oosit içine sitoplazmik içeriğini sıkma sonra sözleşme (S11), hücreler. Hemşire Hücreler daha sonra hücre ölümünü (S12-S13) 4 geçmesi ve folikül hücreler, yumurtaların 5 (Şekiller 1 E-G) salgılar ve desen. Böylece, oogenezisin sonu önemli gelişimsel An ile zengind morfogenetik süreçler.
İzole orta-geç evre folikül (S10B-S14) ve moleküler analizlere dahil olmak üzere çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, aşamalı foliküllerden mRNA RT-PCR, mikrodizi için izole edilebilir, ya da RNA-seq analiz eder. Bu bir hediye, sadece birkaç hücre tipleri ile, kısa bir gelişimsel pencere içinde gen ifadelerine bakılması ve gen ekspresyon farmakolojik veya genetik ya pertürbasyonlarm nasıl değiştiğini belirlemek için izin verir. Aşama izolasyonu da western blotting ile protein bakmak için kullanılabilir. Bu belirli aşamalarında mutantlann karşı yabani tip protein ekspresyonu seviyesini ölçmek için izin verir, çünkü bu tür bir analiz önemlidir. Bir kullanımı olsa da immünofloresan flüoresans ölçümü nedeniyle piksellerin her algılama 6 lineer aralığında sıkı gereksinimleri daha az sağlam olan, benzer sonuçlar elde etmek için analiz eder. Buna ek olarak, western blot analizi, diğer bilgileri sağlayan bu tür birs protein çevrim sonrası modifiye edilir ya da belirli bir ek yeri izoform eksprese ise. Izole edilmiş hücre altı paya ayırma aşamaları da dahil olmak üzere, daha fazla veya coimmunoprecipitation protein saflaştırma için kullanılabilir.
Aşama özgü folikül izolasyonu da in vitro tahliller gelişme 7 ve canlı-8 görüntüleme için kullanılabilir. İzole S10B-S13 folikül (aşağıya bakınız) basit bir kültür ortamı içinde S14 geliştirmek devam edecektir. Bu S10A folikülleri bu yazıda tartışılan kültür koşulları kullanılarak damping hemşire hücre yoluyla ilerleme olmayacağını dikkat etmek önemlidir. Biz okumak-çıkışları 7,9 olarak hemşire damping hücre ve gelişme ile aktin yeniden düzenleyen, hem de farmakolojik ve genetik, prostaglandinlerin rolünü tanımlamak için S10B in vitro geliştirme deneyleri kullandık. Benzer şekilde, daha sonraki gelişim aşamaları, aynı zamanda farmakolojik tedaviler veya genetik erkek etkilerini belirlemek için izole edilebilirBöyle merkezcil hücre göçü, dorsal apendiks göç / oluşumu 10, ve hemşire hücre ölümü gibi belirli süreçlere ipulations. Bu gibi deneyler, dominant etkileşim ekranlar veya tahlilleri yapmak için kullanılabilir, örneğin, PXT veya fascin tek mutasyonlar heterozigozite S10B in vitro gelişimi üzerine bir etkisi varken, çift heterozigot sergi hemşire hücre kusurları ve geliştirme 9'daki bir blok boşaltmaması folikül.
S10B-13 kültür geliştirebilir çünkü Ayrıca, bu süre esnasında meydana gelen işlemlerin tüm canlı görüntüleme ile gözlenebilir. Bu tür bir görüntüleme, sadece flüoresan probları ya da canlı görüntüleme boyalarla boyanmış köklerini ifade eden transjenik sinekleri kullanılarak (bir morfoloji toplam değişiklikleri sadece ilgi ise) iletilen ışık kullanılarak veya konfokal mikroskobu ile gerçekleştirilebilir. Canlı görüntüleme ölçüde gelişim süreçleri anlayışımızı ilerletmek için kullanılıyor. Nitekim, imagin canlıGeç evre köklerinin g dorsal uzantı göç bilgi, tubulogenesis 10 bir örnek genişletti. Biz damping hemşire hücre sırasında aktin dinamikleri dahil olmak üzere ek geç evre süreçleri, canlı görüntüleme, bu gelişimsel olayların yeni bakış açıları sağlayacak bekliyoruz. Bu S10A ve folikül gelişiminin erken aşamalarında kültüründe S14 haline devam ederken, gelişim bu dönemlerinde meydana gelen olaylar canlı görüntüleme (daha fazla bilgi için Tartışma bakın alternatif kültür koşullarında 11-14 ile mümkün olduğuna dikkat etmek önemlidir bilgisi).
İşte biz ya in vitro gelişimi için geç dönem köklerinin izole etmek için ayrıntılı protokoller sağlamak ve canlı görüntüleme, veya moleküler analizleri (mRNA ve protein izolasyonu).
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila folikül morfolojik ve moleküler analizlerin her ikisi için de idealdir, hücre tipleri çok az sayıda oluşmaktadır. Üstelik, yumurtalık yapısına, ortak bir kesme alanı ve en az eğitim ile folikül gelişiminin belirli aşamalarında çok sayıda elde etmek nispeten kolaydır. Her aşamada bir kısa zamansal pencereyi temsil gibi, sahne izolasyon bu evrede meydana gelişim süreçlerine önemli moleküler anlayışlar sağlayabilir. Örneğin, S10B, S12, S14 ve 18 sırasında me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz reaktifler için Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: GFP hattı), Bloomington Stok Merkezi'ni ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası'na teşekkür etmek istiyorum. Biz daha yazının yararlı tartışmalar ve eleştiriler için Tootle Lab tüm üyelerini teşekkür ederim. Dan fon Ulusal Bilim Vakfı MCB-1158527, ve Anatomi ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nden start-up fonları, Iowa Üniversitesi bu çalışmaları destekledi. Farmakolojik Bilimler T32GM067795 Sağlık predoctoral Eğitim Grant National Institutes AJS desteklenmektedir. Veri depolama desteği Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve Grant UL1RR024979 yoluyla Translational Bilimler, Ulusal Sağlık Enstitüleri, ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından desteklenen CTSA yoluyla finanse edilmektedir ICTS tarafından sağlandı.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
References
- Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
