Iskæmireperfusion Model akut nyreskade og Post Injury Fibrose i mus

Summary

Vi beskriver modeller for moderat og svær iskæmireperfusion-induceret nyreskade, hvor musene undergår unilateral renal stilken fastspænding efterfulgt af samtidige eller forsinket kontralateral nefrektomi, hhv. Disse modeller konsekvent giver anledning til renal dysfunktion og efter skaden fibrose, men skaden sværhedsgrad og overlevelse er afhængige af muse baggrund, alder og kirurgisk udstyr.

Abstract

Iskæmireperfusion induceret akut nyreskade (IR-AKI) er vidt udbredt som en model for AKI i mus, men resultaterne er ofte ganske variable med høje, ofte urapporteret dødelighed, der kan forvirre analyser. Bilateral renal stilken fastspænding er almindeligt anvendt til at inducere IR-AKI, men forskellene mellem effektiv standsnings pres og / eller nyre reaktioner på iskæmi mellem nyrerne ofte føre til mere varierende resultater. Desuden er kortere klemme gange kendt for at inducere mere variabel rørformet skade, og mens mus gennemgår bilateral skade med længere clamp tider udvikle mere sammenhængende rørformet skade, de ofte dør inden for de første 3 dage efter skade som følge af svær nyreinsufficiens. For at forbedre efter skaden overlevelse og få mere ensartede og forudsigelige resultater, har vi udviklet to modeller af ensidig iskæmireperfusion skade efterfulgt af kontralateral nefrektomi. Begge operationer udføres ved hjælp af en dorsal fremgangsmåde, reducerer kirurgisk stress som følge from ventrale laparotomi, der almindeligvis anvendes til muse IR-AKI operationer. Til induktion af moderat skade BALB / c-mus gennemgå ensidig fastspænding af nyrernes stilken for 26 min og også gennemgå samtidige kontralateral nefrektomi. Med denne fremgangsmåde, 50-60% af musene udvikler moderat AKI 24 timer efter skaden, men 90-100% af musene overlever. At inducere mere alvorlig AKI, BALB / c-mus renal stilken fastspænding i 30 minutter efterfulgt af kontralateral nefrektomi 8 dage efter skaden. Dette tillader funktionel vurdering af renal recovery efter skade med 90-100% overlevelse. Tidlig efter skaden rørformet skader samt efter skaden fibrose er meget konsekvent at bruge denne model.

Introduction

En række eksperimentelle modeller af akut nyreskade (AKI) er blevet udviklet til at matche mangfoldigheden og kompleksiteten af den menneskelige tilstand (se reference for en nyere, omfattende gennemgang ^1). Hver af disse modeller har sine egne styrker og svagheder, og mens hver efterligner de tilsvarende menneskelige forhold med varierede effektivitetsgevinster ingen præcist modellere patofysiologi deres menneskelige modstykker. Iskæmireperfusion (IR)-induceret AKI er udviklet som en model for akut iskæmi-induceret nyreskade hos gnavere. Mens sværhedsgrad af renal tubulær skade ses i denne model sjældent observeret hos patienter med nyre-hypoperfusion skader ^2, på trods af sine begrænsninger, og især på grund af den relativt reproducerbar karakter af denne model, har dens omfattende brug forudsat, og det forventes, vil fortsætte at give vigtige indsigter i mange af de fælles grundlæggende mekanismer i AKI, reparation og terapi ^3.. IR operation kræver familiarity med musen nyre anatomi, som vi har vist i en forenklet form i figur 1.. Renal iskæmireperfusion (IR) skade kirurgi kan udføres via ventrale (laparotomi), eller dorsal (retroperitoneal) tilgange. Vi bruger en dorsal tilgang, da det er mindre traumatisk, så hurtigere genopretning gange og forbedret overlevelse (især når først at lære af proceduren). Renal IR skaden kan udføres ensidigt eller bilateralt. Men forskellene mellem de effektive clamp tryk (hvilket kan skyldes indskudt perihilar fedt mellem klemmekæberne) og / eller forskelle i den renale reaktioner på iskæmi mellem siderne fører til mere varierende resultater. Selvom dette ikke er et uoverstigeligt problem, kan det øge variabilitet mellem eksperimenter, hvilket er et stort problem for denne model. Ensidig IR kan udføres med kontra-lateral nefrektomi. Dette er vores foretrukne metode, da det reducerer variabiliteten i fastspænding mellem pedicles, og samtidig enllows én at evaluere nyrefunktionen, som er upåvirket med ensidig IR alene. Der har været diskussion om, hvad der er den mest praktiske vs optimale metode til at vurdere nyrefunktionen hos mus. Blodureanitrogen (BUN) giver et mål for nyrefunktionen og er et nyttigt "første kig" markør i nogle modeller af AKI, herunder IR skade. Dog kan BUN niveauer blive påvirket af volumen status af musene, der kan blive berørt, især efter ventral tilgang IR skade, når forsinkede opsving reducerer indtagelse af væske for en række dage efter kirurgi. Serumkreatinin er mindre påvirket af hydreringsstatus men er tydeligt påvirket af muskelmasse. En af vanskelighederne med måling af serumkreatinin har været problemer med detektering af ikke-kreatinin chromogener i museserum med pikrinsyre baserede teknikker. Som et alternativ, har en række centre udviklet en HPLC-metode til at kvantificere musen kreatinin, der ikke påvirkes af denne artefakt ^4.. Men UNLIke BUN og pikrinsyre kreatinin assays, der kun kræver 5-10 pi serum, HPLC-analyserne kræver ~ 25 ul serum pr assay, som hvis den udføres i to eksemplarer vil kræve ~ 100 pi af fuldblod pr assay. Dette kan være begrænsende for musestudier. Nogle centre har udviklet mere følsomme HPLC og massespektrometri-baserede metoder, der tillader analyse af mindre prøvevolumener ^{5, 6.} Men disse teknologier er ikke almindeligt tilgængelig. En alternativ, enzymatisk kaskade assay (som kun kræver 5-10 pi serum) er blevet vurderet i mus og rotter serumprøver og vist til nøje parallel HPLC målinger af serumkreatinin mens pikrinsyre assays altid overvurdere kreatinin ^7.. Mens dette assay ikke er almindeligt anvendt i AKI litteratur, assayet er kommercielt tilgængelige, let at bruge, og vi finder giver pålidelige resultater med denne model af IR-induceret AKI i mus.

Protocol

Autoklavér alle kirurgiske instrumenter før operation. Bemærk, at hvis man udfører flere operationer på forskellige mus, skylles instrumenter efter brug, og derefter sterilisere ved hjælp af en varm perle sterilisator. Det er ikke tilstrækkeligt at suge i 70% ethanol. Giv 0,5 ml S / C sterilt saltvand præoperativt og umiddelbart postoperativt for at kompensere for tab af kropsvæske under operationen. Afveje mus. Bedøver musen brug af IP xylazin / ketamin blanding. Det tager normalt 3-5 minutter f…

Representative Results

Moderat IR-induceret AKI. Ensidig IR med samtidig kontralateral nefrektomi væsentligt reducerer variabiliteten i resultaterne, men med kortere clamp gange nødvendige for musene at overleve denne fremgangsmåde stadig vi fandt, at kun 50-60% af musene udviklede den forventede nyreinsufficiens 24 hr efter skade (figur 3A). I praksis betyder dette skaber problemer evaluere data, medmindre disse inddrager behandlingsregimer, der kan iværksættes i mindst 24 timer efter skaden, så der er…

Discussion

Vi beskriver to modeller af IR-AKI at studere virkningerne af et moderat og svær nyreskade. Disse modeller tillader os at fremkalde ensartede og forudsigelige skader med lav dødelighed. Vores protokol skitserer mange af de vanskeligheder og faldgruber der traditionelt er forbundet med denne model. Endvidere har vi vist, at afhængigt af længden af ​​renal pedicle fastspænding, modellen inducerer en stort set reversibel mild og moderat AKI, eller mere alvorlig AKI med ufuldstændig genopretning og vedvarende rena…

Materials

Drug or solution	Company	Catalogue number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
			Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15″ W x 24″ Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2” x 2” Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
			Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.