Vi beskriver modeller av moderat og alvorlig ischemi-reperfusjon-induserte nyreskade i hvilken musene gjennomgår unilateral nyre stilken fastspenning etterfulgt av simultan eller forsinket kontralaterale nefrektomi, henholdsvis. Disse modellene konsekvent gir opphav til renal dysfunksjon og etter skade fibrose, men alvorlig skade og overlevelse er avhengige mus bakgrunn, alder og kirurgisk utstyr.
Iskemi-reperfusjon indusert akutt nyreskade (IR-AKI) er mye brukt som en modell av AKI i mus, men resultatene er ofte ganske variabel med høye, ofte urapportert dødelighet som kan forvirrer analyser. Bilateral renal pedicle Klemmingen vanligvis brukes til å indusere IR-AKI, men forskjellene mellom effektive klemme press og / eller nyre svar på iskemi mellom nyrer ofte føre til mer variable resultater. I tillegg er kortere klemme ganger kjent for å indusere mer variabel rørformet skade, og mens musene som gjennomgår bilateral skade med lengre klemme ganger utvikle mer konsekvent rørformet skade, de ofte dør innen de første tre dagene etter skade på grunn av alvorlig nyresvikt. For å bedre etter skade overlevelse og få mer konsistente og forutsigbare resultater, har vi utviklet to modeller av ensidig iskemi-reperfusjon skade etterfulgt av kontralateral nefrektomi. Begge operasjonene er utført ved hjelp av en dorsal tilnærming, redusere kirurgisk stress som følge from ventral laparotomi, som vanligvis brukes for mus IR-AKI operasjoner. For induksjon av moderate skader BALB / c mus gjennomgå ensidig klemming av nedsatt pedicle for 26 min og også gjennomgå samtidig kontralateral nefrektomi. Ved hjelp av denne tilnærmingen, 50-60% av musene utvikler moderat AKI 24 timer etter skade, men 90-100% av mus overleve. Å indusere mer alvorlig AKI, BALB / c mus gjennomgå renal pedicle klemming i 30 min etterfulgt av kontralateral nefrektomi 8 dager etter skade. Dette gjør funksjonell vurdering av nedsatt restitusjon etter skade med 90-100% overlevelse. Tidlig etter skade tubuliskade samt post skade fibrose blir meget ensartet ved hjelp av denne modellen.
En rekke eksperimentelle modeller av akutt nyreskade (AKI) er utviklet for å matche mangfoldet og kompleksiteten i den menneskelige tilstand (se referanse for en fersk, omfattende gjennomgang 1). Hver av disse modellene har sine egne styrker og svakheter, og mens hver etterligner de tilsvarende menneskelige forhold med varierte effektivitet, ingen nøyaktig modellere patofysiologien av sine menneskelige kolleger. Iskemi reperfusjon (IR)-indusert AKI har blitt utviklet som en modell for akutt iskemi nyreskade hos gnagere. Mens alvorlighetsgrad av renal tubulær skade sett i denne modellen er sjelden observert hos pasienter med nedsatt hypoperfusjon skader 2, til tross for sine begrensninger og i stor grad på grunn av den relativt reproduserbar natur av denne modellen, har sin omfattende bruk, forutsatt, og det er forventet, vil fortsette å gi viktig innsikt i mange av de felles grunnleggende mekanismene for AKI, reparasjon og terapi tre. IR kirurgi krever familiarity med musen nyre anatomi, som vi har vist i en forenklet form i figur 1. Nedsatt iskemi-reperfusjon (IR) skade kirurgi kan utføres via ventral (laparotomi) eller dorsal (retroperitoneal) tilnærminger. Vi bruker en dorsal tilnærming siden det er mindre traumatisk, slik at raskere utvinning ganger og forbedret overlevelse (spesielt når den først lære prosedyren). Nedsatt IR skade kan utføres ensidig eller bilateralt. Imidlertid fører forskjeller mellom effektive klemme press (noe som kan resultere fra interposition av perihilar fett mellom klemmen) og / eller forskjeller i renal svar på iskemi mellom sidene til mer variable resultater. Mens dette ikke er et uoverstigelig problem, kan det øke variabiliteten mellom eksperimenter, som er et stort problem for denne modellen. Ensidig IR kan utføres med contra-lateral nephrectomy. Det er vår metode for valg siden den reduserer variabiliteten i fastspenning mellom pedicles, og på samme tid enllows en å vurdere nyrefunksjonen, som er upåvirket med unilateral IR alene. Det har vært diskusjon om hva som er den mest praktiske g. optimale metode for å vurdere nyrefunksjonen hos mus. Blod urea nitrogen (BUN) er et mål på nyrefunksjonen og er et nyttig "first look" markør i enkelte modeller av AKI, inkludert IR skade. Imidlertid kan BUN nivåene påvirkes av volum status av musene som kan bli påvirket, spesielt etter ventrale tilnærming IR skade, da forsinket gjenvinning reduserer oralt inntak av væske til et antall dager etter kirurgi. Serum kreatinin er mindre påvirket av væskebalansen, men er tydelig preget av muskelmasse. En av vanskelighetene med serumkreatinin målinger har vært problemer med deteksjon av ikke-kreatinin kromogener i museserum ved hjelp av pikrinsyre baserte teknikker. Som et alternativ, har en rekke sentre utviklet en HPLC-basert metode for å kvantifisere mus kreatinin som ikke er berørt av denne gjenstand fire. Men unlike BUN og pikrinsyre kreatinin-analyser, som bare krever 5-10 mL serum, HPLC-analyser krever ~ 25 mL serum per analysen, som hvis det utføres i duplikat vil kreve ~ 100 mL fullblod per analysen. Dette kan være begrensende for mus studier. Noen sentre har utviklet mer sensitive HPLC og massespektrometri-baserte metoder som tillater analyse av mindre prøvevolumer 5, 6. Men disse teknologiene ikke er allment tilgjengelig. Et alternativ, enzymatisk kaskade analysen (som krever bare 5-10 mL serum) har blitt evaluert i mus og rotter serumprøver og vist til tett parallell HPLC målinger av serum kreatinin mens pikrinsyre analyser alltid over-estimat kreatininverdier 7. Selv om denne assay ikke blir mye brukt i den AKI litteraturen, er analysen kommersielt tilgjengelig, lett å bruke, og vi finner gir pålitelige resultater med denne modell av IR-indusert AKI i mus.
Vi beskriver to modeller av IR-AKI å studere virkningene av moderat og alvorlig nyreskade. Disse modellene tillate oss å indusere konsekvent og forutsigbar skade med lav dødelighet. Vår protokollen skisserer mange av de vanskeligheter og fallgruver tradisjonelt forbundet med denne modellen. Videre har vi vist at avhengig av lengden på renal pedicle festebraketter, induserer modellen en stor grad reversibel mild og moderat AKI, eller mer alvorlig AKI med ufullstendig utvinning og vedvarende nedsatt fibrose. Etter sk…
The authors have nothing to disclose.
Dr. de Caestecker laboratorium støttes av NIH 1RO1 HL093057-01 og 1RC4DK090770-01. Dr. Harris 'laboratorium er støttet av DK38226, DK51265, DK62794 og finansiering fra Veterans Administration. Støtte for mus nyreskade operasjoner, serum kreatinin og fibrose analysene også levert av Vanderbilt O'Brien Nyre Injury senter stipend 1P30 DK079341.
Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
Tape | Durapore | 1538-0 | |
1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |