Iskemi-reperfusjon Modell av akutt nyreskade og Post Injury fibrose i Mus

Summary

Vi beskriver modeller av moderat og alvorlig ischemi-reperfusjon-induserte nyreskade i hvilken musene gjennomgår unilateral nyre stilken fastspenning etterfulgt av simultan eller forsinket kontralaterale nefrektomi, henholdsvis. Disse modellene konsekvent gir opphav til renal dysfunksjon og etter skade fibrose, men alvorlig skade og overlevelse er avhengige mus bakgrunn, alder og kirurgisk utstyr.

Abstract

Iskemi-reperfusjon indusert akutt nyreskade (IR-AKI) er mye brukt som en modell av AKI i mus, men resultatene er ofte ganske variabel med høye, ofte urapportert dødelighet som kan forvirrer analyser. Bilateral renal pedicle Klemmingen vanligvis brukes til å indusere IR-AKI, men forskjellene mellom effektive klemme press og / eller nyre svar på iskemi mellom nyrer ofte føre til mer variable resultater. I tillegg er kortere klemme ganger kjent for å indusere mer variabel rørformet skade, og mens musene som gjennomgår bilateral skade med lengre klemme ganger utvikle mer konsekvent rørformet skade, de ofte dør innen de første tre dagene etter skade på grunn av alvorlig nyresvikt. For å bedre etter skade overlevelse og få mer konsistente og forutsigbare resultater, har vi utviklet to modeller av ensidig iskemi-reperfusjon skade etterfulgt av kontralateral nefrektomi. Begge operasjonene er utført ved hjelp av en dorsal tilnærming, redusere kirurgisk stress som følge from ventral laparotomi, som vanligvis brukes for mus IR-AKI operasjoner. For induksjon av moderate skader BALB / c mus gjennomgå ensidig klemming av nedsatt pedicle for 26 min og også gjennomgå samtidig kontralateral nefrektomi. Ved hjelp av denne tilnærmingen, 50-60% av musene utvikler moderat AKI 24 timer etter skade, men 90-100% av mus overleve. Å indusere mer alvorlig AKI, BALB / c mus gjennomgå renal pedicle klemming i 30 min etterfulgt av kontralateral nefrektomi 8 dager etter skade. Dette gjør funksjonell vurdering av nedsatt restitusjon etter skade med 90-100% overlevelse. Tidlig etter skade tubuliskade samt post skade fibrose blir meget ensartet ved hjelp av denne modellen.

Introduction

En rekke eksperimentelle modeller av akutt nyreskade (AKI) er utviklet for å matche mangfoldet og kompleksiteten i den menneskelige tilstand (se referanse for en fersk, omfattende gjennomgang ^1). Hver av disse modellene har sine egne styrker og svakheter, og mens hver etterligner de tilsvarende menneskelige forhold med varierte effektivitet, ingen nøyaktig modellere patofysiologien av sine menneskelige kolleger. Iskemi reperfusjon (IR)-indusert AKI har blitt utviklet som en modell for akutt iskemi nyreskade hos gnagere. Mens alvorlighetsgrad av renal tubulær skade sett i denne modellen er sjelden observert hos pasienter med nedsatt hypoperfusjon skader ^2, til tross for sine begrensninger og i stor grad på grunn av den relativt reproduserbar natur av denne modellen, har sin omfattende bruk, forutsatt, og det er forventet, vil fortsette å gi viktig innsikt i mange av de felles grunnleggende mekanismene for AKI, reparasjon og terapi ^tre. IR kirurgi krever familiarity med musen nyre anatomi, som vi har vist i en forenklet form i figur 1. Nedsatt iskemi-reperfusjon (IR) skade kirurgi kan utføres via ventral (laparotomi) eller dorsal (retroperitoneal) tilnærminger. Vi bruker en dorsal tilnærming siden det er mindre traumatisk, slik at raskere utvinning ganger og forbedret overlevelse (spesielt når den først lære prosedyren). Nedsatt IR skade kan utføres ensidig eller bilateralt. Imidlertid fører forskjeller mellom effektive klemme press (noe som kan resultere fra interposition av perihilar fett mellom klemmen) og / eller forskjeller i renal svar på iskemi mellom sidene til mer variable resultater. Mens dette ikke er et uoverstigelig problem, kan det øke variabiliteten mellom eksperimenter, som er et stort problem for denne modellen. Ensidig IR kan utføres med contra-lateral nephrectomy. Det er vår metode for valg siden den reduserer variabiliteten i fastspenning mellom pedicles, og på samme tid enllows en å vurdere nyrefunksjonen, som er upåvirket med unilateral IR alene. Det har vært diskusjon om hva som er den mest praktiske g. optimale metode for å vurdere nyrefunksjonen hos mus. Blod urea nitrogen (BUN) er et mål på nyrefunksjonen og er et nyttig "first look" markør i enkelte modeller av AKI, inkludert IR skade. Imidlertid kan BUN nivåene påvirkes av volum status av musene som kan bli påvirket, spesielt etter ventrale tilnærming IR skade, da forsinket gjenvinning reduserer oralt inntak av væske til et antall dager etter kirurgi. Serum kreatinin er mindre påvirket av væskebalansen, men er tydelig preget av muskelmasse. En av vanskelighetene med serumkreatinin målinger har vært problemer med deteksjon av ikke-kreatinin kromogener i museserum ved hjelp av pikrinsyre baserte teknikker. Som et alternativ, har en rekke sentre utviklet en HPLC-basert metode for å kvantifisere mus kreatinin som ikke er berørt av denne gjenstand ^fire. Men unlike BUN og pikrinsyre kreatinin-analyser, som bare krever 5-10 mL serum, HPLC-analyser krever ~ 25 mL serum per analysen, som hvis det utføres i duplikat vil kreve ~ 100 mL fullblod per analysen. Dette kan være begrensende for mus studier. Noen sentre har utviklet mer sensitive HPLC og massespektrometri-baserte metoder som tillater analyse av mindre prøvevolumer ^{5, 6.} Men disse teknologiene ikke er allment tilgjengelig. Et alternativ, enzymatisk kaskade analysen (som krever bare 5-10 mL serum) har blitt evaluert i mus og rotter serumprøver og vist til tett parallell HPLC målinger av serum kreatinin mens pikrinsyre analyser alltid over-estimat kreatininverdier ^7. Selv om denne assay ikke blir mye brukt i den AKI litteraturen, er analysen kommersielt tilgjengelig, lett å bruke, og vi finner gir pålitelige resultater med denne modell av IR-indusert AKI i mus.

Protocol

Autoklaver alle kirurgiske instrumenter før operasjonen. Merk at hvis man utfører flere operasjoner på forskjellige mus, skyll instrumenter etter bruk og deretter sterilisere med en varm perle sterilisator. Det er ikke tilstrekkelig til å synke ned i 70% etanol. Gi 0,5 ml S / C steril normal saltløsning preoperativt og umiddelbart postoperativt å kompensere for tap av kroppsvæske under operasjonen. Vei musene. Anesthetize mus ved hjelp av IP Urea / Ketamin blanding. Det tar vanligvis 3-5 minutter fo…

Representative Results

Moderat IR-indusert AKI. Ensidig IR med samtidig contralateral nephrectomy reduserer betydelig variasjon i resultatene, men med kortere klemme ganger nødvendige for musene å overleve denne prosedyren, vi likevel funnet at bare 50-60% av musene utviklet forventet nyresvikt 24 timer etter skade (figur 3A). I praksis skaper vanskeligheter evaluere data med mindre studier omfatter behandlingsregimer som kan startes i minst 24 timer etter skaden, slik at tid til å vurdere nyrefunksjonen o…

Discussion

Vi beskriver to modeller av IR-AKI å studere virkningene av moderat og alvorlig nyreskade. Disse modellene tillate oss å indusere konsekvent og forutsigbar skade med lav dødelighet. Vår protokollen skisserer mange av de vanskeligheter og fallgruver tradisjonelt forbundet med denne modellen. Videre har vi vist at avhengig av lengden på renal pedicle festebraketter, induserer modellen en stor grad reversibel mild og moderat AKI, eller mer alvorlig AKI med ufullstendig utvinning og vedvarende nedsatt fibrose. Etter sk…

Materials

Drug or solution	Company	Catalogue number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
			Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15″ W x 24″ Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2” x 2” Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
			Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.