Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l'aide Time-lapse de microscopie confocale
Summary
Visualisation des données expérimentales est devenu un élément clé dans la présentation des résultats à la communauté scientifique. Génération de direct enregistrement time-lapse d'embryons croissance contribue à une meilleure présentation et la compréhension des processus de développement complexes. Ce protocole est un guide pour le marquage des cellules par l'intermédiaire de photoconversion de la protéine chez le poisson zèbre kaede étape par étape.
Abstract
Vertébré palatogenesis est un processus de développement très chorégraphiée et complexe, qui implique la migration de la crête neurale crânienne (CNC) des cellules, la convergence et l'extension des protubérances du visage, et la maturation du squelette cranio-facial. Pour étudier la contribution de la crête neurale crânienne à des régions spécifiques du palais de poisson zèbre un de SOX10: Kaede ligne de poisson zèbre transgénique a été généré. Sox10 fournit restriction de la lignée de la protéine Kaede rapporteur de la crête neurale, ce qui rend la cellule étiquetage d'un processus plus précis que colorant traditionnel ou injection d'ARNm rapporteur. Kaede est une protéine de photo-convertible qui passe du vert au rouge après l'activation de photo et permet de suivre précisément les cellules. Les SOX10: Kaede ligne transgénique a été utilisé pour effectuer une analyse de la lignée de délimiter les populations de cellules CNC qui donnent lieu à maxillaire par rapport à des éléments mandibulaires et illustrent homologie des protubérances du visage pour amniotes. Ce protocole décrit l'étape consistant às pour générer une vidéo en time-lapse en direct d'un SOX10: embryon de poisson zèbre Kaede. Développement de la plaque ethmoïde servira un exemple pratique. Ce protocole peut être appliqué à la réalisation d'un time-lapse enregistrement confocale de toute Kaede ou protéine rapporteur photoconvertible similaire chez le poisson zèbre transgénique. En outre, il peut être utilisé pour capturer non seulement normal, mais aussi anormale développement des structures craniofaciales dans les mutants de poisson zèbre.
Introduction
Les fentes faciales représentent la déformation craniofaciale la plus répandue, avec 1/700-1, 000 livraisons affectées 1. Perturbation du développement cranio-facial embryonnaire précoce peut conduire à la formation de fente labio-palatine (FL / P). Bien que les causes de fissure syndromique ont été largement représenté, les bases génétiques et épigénétiques de formes non syndromiques de clefting buccofaciale doivent encore être mis au jour 2-4. Afin de comprendre l'étiologie et la pathogenèse de ces malformations, il est nécessaire d'élucider le développement des structures craniofaciales sur une base cellulaire.
Dans toutes les espèces de vertébrés cellules de la crête neurale crânienne (CNCC) migrent du tube neural dorsal pour remplir les arcs pharyngiens, ce qui contribuera à la formation de structures oro-faciales. Perturbation du développement précoce de la crête neurale embryonnaire peut conduire à la formation de malformations cranio-faciales, y compris CL / P 5-7.
Dans annoncecondition des similitudes structurelles entre le poisson zèbre et le développement cranio-facial chez les mammifères (CNCCs résident dans des régions homologues), le réseau de régulation génique est hautement conservée. Il a également été montré que CNCCs développer de la même manière entre les espèces de poisson-zèbre amniote et 8, ce qui rend le poisson zèbre d'un organisme efficace pour l'étude de la génétique et développementale base de CL / P. Il présente de nombreux avantages, y compris de petite taille, rapide et ex-utero le développement embryonnaire, et les taux de reproduction élevé. De plus, l'embryon est optiquement transparent, ce qui prête à l'observation d'événements complexes de développement sous la loupe 9. Il s'agit d'un modèle animal idéal pour l'étude de la migration et la différenciation des cellules de la crête neurale crâniens.
Étendre sur le travail déjà publié 8, 10, 11, le modèle migratoire de la CNCC a été décrite en détail à l'aide des SOX10: Kaede modèle transgénique 5. Kaede est une protéine de photo-convertible que turns du vert au rouge après l'activation de photo et permet de retracer CNCCs précisément. Au cours de cette transformation dans le squelette peptidique est clivée, ce qui suggère que la conversion est stable, ce qui signifie les cellules peuvent être suivis à leur destination finale 12. Les lignées transgéniques étiquetés avec kaede sous contrôle transcriptionnel d'SOX10 ont montré que la bouche de amniote et la plaque ethmoïde de poisson-zèbre sont formées de manière homologue par fusion de saillies maxillaires bilatérales (MXP) avec la proéminence frontonasal (FNP), et que la couture de fusion en forme de Y est similaire entre espèces.
Parmi d'autres applications, les SOX10: Kaede transgénique modèle de poisson zèbre a été utilisé pour générer des vidéos de embryons de poisson zèbre à différents stades de développement de montrer la formation de structures cranio-faciales normales et anormales. Photoconversion de groupes spécifiques de cellules, il est possible de suivre leur développement. Avec cette méthode, une approche pour créer l'imagerie en direct de développer craniofacstructures ial chez le poisson zèbre est introduit, le rendant facile à démontrer visuellement ce processus complexe du développement.
Ce protocole vise à partager l'expérience de la production de ces vidéos à l'aide au développement normal de la plaque ethmoïde dans SOX10: poisson zèbre transgénique Kaede, par exemple. Ce protocole peut en outre être appliquée à faire des vidéos time-lapse de toute structure dérivée de cellules de la crête neurale crânienne chez le poisson zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voici une nouvelle méthode pour la visualisation de développement cranio-facial dans le modèle de poisson zèbre est affiché. Les SOX10: Kaede ligne de poisson zèbre transgénique a été utilisé avec succès pour décrire le modèle migratoire de la CNCC en détail est utilisé comme organisme modèle 5.
Des études antérieures ont utilisé des repères bruts tels que l'œil aux cellules cibles et se sont appuyés sur l'injection Kaede de l'ARNm, des essais de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Robert Kelsh pour avoir bien voulu partager le poisson zèbre réactif promoteur SOX10.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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