ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal
Summary
ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.
Abstract
palatogenesis חוליות הוא תהליך התפתחותי כוריאוגרפיה והמורכב ביותר, הכולל הגירה של רכס עצבי גולגולתי (CNC) תאים, התכנסות והרחבה של בליטות פנים, והתבגרות של שלד craniofacial. כדי ללמוד את התרומה של הרכס העצבי הגולגולת לאזורים ספציפיים של חיך דג הזברה sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד נוצר. Sox10 מספק הגבלת שושלת של חלבון כתב קאאד לרכס העצבי, ובכך הופך את תא תיוג תהליך מדויק יותר מאשר צבע מסורתי או הזרקת mRNA כתב. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שהופך מירוק לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשר לעקוב אחר תאים בדיוק. Sox10: הקו מהונדס קאאד שימש לביצוע ניתוח שושלת להתוות אוכלוסיות תאי CNC כי להצמיח לסת מול לסת תחתון, אלמנטים ולהמחיש הומולוגיה של בליטות פנים לamniotes. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים כדי ליצור וידאו חי זמן לשגות של sox10: עובר דג הזברה קאאד. פיתוח של צלחת כברתי ישמש כדוגמא מעשית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ביצוע הקלטת confocal זמן לשגות של כל קאאד או חלבון כתב photoconvertible דומה בדג זברה מהונדס. יתר על כן, ניתן להשתמש בו כדי ללכוד את הפיתוח לא רק נורמלי, אלא גם לא תקין של מבני craniofacial במוטנטים דג הזברה.
Introduction
בתרי orofacial מייצג את עיוות craniofacial הנפוצה ביותר, עם 1/700-1, 000 משלוחים השפיעו 1. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת craniofacial יכול להוביל להיווצרות של שפה שסועה וחך (CL / P). בעוד סיבות לשסועות syndromic הוכחו במידה רבה, את הבסיסים הגנטיים ואפיגנטיים של צורות nonsyndromic של clefting orofacial עדיין צריכים להיחשף 2-4. על מנת להבין את האטיולוגיה ופתוגנזה של מומים אלה, יש צורך להבהיר את התפתחות מבני craniofacial על בסיס סלולארי.
בכל מיני החולייתנים תאי גולגולת עצביים רכס (CNCC) להעביר מהצינור העצבי הגבי כדי לאכלס את קשתות בלוע, אשר יתרמו להיווצרות של מבני orofacial. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת רכס עצבי יכול להוביל להיווצרות של מומים craniofacial כולל CL / P 5-7.
במודעהdition לדמיון מבני בין דג הזברה ופיתוח craniofacial יונקים (CNCCs מתגורר באזורים הומולוגיים), רשת הרגולציה הגן זה שמור ביותר. כמו כן, הוכיח כי CNCCs לפתח באותו אופן בין מיני amniote ודג הזברה 8, מה שהופך את דג הזברה אורגניזם רב עוצמה ללימוד בסיס ההתפתחותי והגנטי של CL / פ יש לו יתרונות רבים, לרבות גודל קטן, מהיר והתפתחות עוברית לשעבר ברחם, ושיעורי גידול גבוהים. יתר על כן, העובר הוא שקוף אופטי, מה שהופך אותו נוח לתצפית של אירועים התפתחותיים מורכבים מתחת למיקרוסקופ 9. זהו מודל חיה אידיאלי לחקר נדידה וההתמיינות של תאי רכס עצביים גולגולתי.
הרחבת בעבר עבודה שפורסמה 8, 10, 11, דפוס הנדידה של CNCC תואר בפירוט באמצעות sox10: המודל המהונדס קאאד 5. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שtuאחיות מוסמכות מירוקים לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשרת לעקוב אחר CNCCs בדיוק. במהלך השינוי הזה את עמוד השדרה פפטיד הוא ביקע, טוען כי ההמרה היא יציבה, כלומר, יכולים להיות במעקב התאים ליעדן הסופי 12. קווים מהונדסים שכותרתו עם קאאד תחת שליטת תעתיק של sox10 הראו כי חיך amniote וצלחת כברתי של דג הזברה נוצרים homologously על ידי שילוב של בליטות הבילטראליים לסת (MXP) עם בולטות frontonasal (FNP) ושתפר היתוך Y בצורת משול בין מינים.
בין יישומים אחרים, sox10: מודל דג הזברה מהונדס קאאד היה לשמש ליצירת קטעי וידאו של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחותיים שונים כדי להראות היווצרות של מבני craniofacial נורמלים ולא נורמליים. Photoconversion של קבוצות ספציפיות של תאים מאפשרת לעקוב אחר התפתחותם. בשיטה זו גישה ליצור הדמיה חיה של פיתוח craniofacמבני ial בדג הזברה הוא הציג, מה שהופך את זה קל מבחינה ויזואלית להדגים תהליך התפתחותי מורכב זה.
פרוטוקול זה מיועד לשיתוף החוויה של יצירת סרטונים אלה באמצעות ההתפתחות התקינה של צלחת כברתי בsox10: דג הזברה מהונדס קאאד לדוגמא ירושלים. פרוטוקול זה עוד יכול להיות מיושם על ביצוע קטעי וידאו הזמן לשגות של כל מבנה שמקורם בתאי רכס עצביים גולגולתי בדג זברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה שיטה חדשה להדמיה של פיתוח craniofacial במודל דג הזברה מוצגת. Sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד כבר השתמש בהצלחה כדי לתאר את דפוס הנדידה של CNCC בפירוט משמש כאורגניזם מודל 5.
מחקרים קודמים השתמשו בציוני דרך גולמית כגון העין למקד את התאי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים רוברט Kelsh לחביבות שיתוף מגיב אמרגן sox10 דג הזברה.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- . Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
