Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren
Summary
Dieser Artikel beschreibt, wie man virale Vektoren in Mäusegehirn microinject und dann in einem konditionierten Platzpräferenz Paradigma, das eine Akquisition, Aussterben und Wiedereinstellung Phase umfasst testen.
Abstract
Mikroinjizieren rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV) Vektoren, die Cre-Rekombinase in verschiedene Maus Hirnregionen gezielt Knockout Gene von Interesse ermöglicht verbesserte zeitlich und regional-spezifische Kontrolle der Gen-Deletion, im Vergleich zu bestehenden Methoden. Während bedingte Löschung kann auch durch Kreuzen Mäusen erreicht werden, dass express Cre-Rekombinase unter der Kontrolle von spezifischen Gen-Promotoren mit Mäusen, die ein floxed Gen stereotaktischen Mikroinjektion zum Targeting von diskreten Hirnarealen bei Experimentator festgelegten Zeitpunkten von Interesse ermöglicht. Im Zusammenhang mit der Kokain klimatisierten Platzpräferenz und andere Kokain Verhaltensparadigmen wie Selbstverwaltung oder psychomotorische Sensibilisierung das kann Rücktritt, Aussterben und / oder Wiedereinstellung Phasen beinhalten, ist diese Technik besonders nützlich in der Erforschung der einzigartigen Beitrag der Zielgene zu diesen unterschiedlichen Phasen der Verhaltensmodelle von Kokain-induzierte Plastizität. InsbesondereDiese Technik ermöglicht die selektive Ablation von Zielgenen in diskreten Phasen des Verhaltens zu ihrem Beitrag zu dem Verhalten in der Zeit zu testen. Letztlich ermöglicht dieses Verständnis für eine gezieltere Therapie, die am besten in der Lage, die stärksten Risikofaktoren, die sich präsentieren in jeder Phase der Suchtverhalten anzusprechen sind.
Introduction
Kokain ist eine stark verstärkende Psychostimulanzien. Nach wiederholter Exposition auftreten mehreren molekularen und zellulären Anpassungen in Lohn-relevante Schaltkreise im Gehirn, die glaubten, in zwanghaften führen, sind Drogen-sucht Verhalten, woraufhin hohen Rückfall, die eine schwerwiegende klinische Problem 1 darstellen. Kokain übt diese langanhaltende Auswirkungen auf das Verhalten von der Regulation der Genexpression. Um die Anpassungen, die an chronischer Kokainkonsum entstehen studieren, haben präklinischen Tiermodellen wurde intensiv genutzt. Ein solches Modell ist das konditionierte Platzpräferenz (CPP) Paradigma. Dieses Modell beinhaltet die Entwicklung eines gelernt Assoziation zwischen einer zuvor neutralen Umgebung und der lohnenden Eigenschaften von Kokain. Nach mehreren Paarungen von Kokain mit einer bestimmten Kammer werden Tiere frei erkunden die Kokain-gepaarten und nicht-Kokain-gepaarten Umgebungen und wenn sie die Droge-gepaarten Fach lieber, man sagt, sie erwarb eine Kokain-induzierte Plac habene Vorlieben. Darüber hinaus ist nach einer vom Aussterben Einarbeitungszeit kann dieses Paradigma verwendet, um kontext-spezifischen Wiedereinsetzung von Kokain-seeking Verhalten zu studieren.
Im Vergleich zu anderen Verhaltensmodelle der süchtig-ähnliches Verhalten, wie psychomotorische Sensibilisierung, die verwendet werden, um langfristige Kokain-induzierte Verhaltens-und molekulare Plastizität 2,3 und Selbstverwaltung (SA) zu studieren ist, das gedacht wird, genauer nachahmen süchtig -ähnliches Verhalten beim Menschen gefunden wird, ist die CPP Paradigma ein einfaches Verfahren, um Kokain kontextuellen Lernen 4 studieren. CPP-Protokolle lassen sich bequem erweitert werden, um Auslöschung und Wiedereinstellung Phasen umfassen, ähnlich wie SA, die für die Untersuchung der Mechanismen, die Gier nach Drogen und Rückfall 5-7 und von denen angenommen wird, um Aspekte von dem, was geschieht in der menschlichen rekapitulieren Drogen-sucht Verhalten und Drogen erlauben – und Cue-induzierten Rückfall 8-10.
Ein Mechanismus zugrunde liegt, dass dieKokain-induzierte Verhaltensänderungen Plastizität, die charakteristisch für jede der verschiedenen Phasen von CPP, einschließlich Erwerb, Löschung und Wiedereinstellung ist, ist die Aktivierung eindeutige Signaturen der Genexpression in verschiedenen Hirnregionen. Um direkt zu testen, welche Gene in Lohn-relevanten Hirnregionen vermitteln Verhaltensänderungen Kokain-induzierte, ist es sinnvoll, in der Lage sein, sie zu manipulieren selektiv in einem regional-spezifische Art und Weise. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen ist, um rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV)-Vektoren, die express Cre-Rekombinase mit stereotaktischen Chirurgie, in verschiedene Hirnareale von Mäusen, die Zielgene von LoxP Websites (floxed Mäuse) flankiert microinject. Dieses Verfahren ermöglicht eine sehr genaue zeitliche und regionale Kontrolle darüber, wann und wo Gene abgetragen werden, in beiden Teilen und nicht teilende Neuronen, ohne eine Immunantwort 11-13. Dieser Grad der Kontrolle stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber herkömmlichen Cre-loxP Technologie der Zucht floxed Mäuse wit Mäusen, die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines endogenen Gen-Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitpunkt und die Verteilung der Gen-Deletion kann mehr genau reguliert werden. Außerdem umgeht viralen Vektor-vermittelte Gen-Knockout Potenzial für Entwicklungsstörungen kompensatorische Effekte, die auftreten, mit traditionellen Ko-Strategien können.
Neben Kokain CPP, die hier beschrieben wird, Mikroinjektion von rAAV-Cre in das Gehirn von Mäusen floxed, um die Rolle von spezifischen Genen kann zu Verhaltensstörungen ubiquitär Paradigmen, die einzelnen Phasen, einschließlich Selbstverwaltung und psychomotorische Sensibilisierung beinhalten angewendet werden zu beurteilen. Zum Beispiel hat unser Labor die rAAV-Cre-Technologie verwendet, um die Rolle von Ca v 1.2 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in Kokain psychomotorische Sensibilisierung 14 studieren. Insbesondere wurde rAAV-Cre in den Nucleus accumbens (NAC) von Mäusen, die mit dem Gen Ca v 1.2 floxed, Mikroinjektion zu zeigen, dass Ca v </sub> 1.2 Handeln in dieser Region vermittelt die Expression Phase der psychomotorischen Sensibilisierung 14,15. Doch die rAAV-Cre-Strategie kann nicht verwendet werden, wenn Mäuse mit einem floxed Gen von Interesse nicht vorhanden sind, wie es unsere Erfahrung bei der Beurteilung der Rolle der Ca v 1.3 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in psychomotorische Sensibilisierung. Daher stellt eine Einschränkung bei der Verwendung rAAV-Cre selbst wenn bedingte Mäusen nicht für ein bestimmtes Gen von Interesse vorhanden sind. Allerdings rAAVs dass express siRNA Knockdown auf Zielgene verwendet werden können, wie wir es getan, um die Rolle von Ca v 1.3 Kanäle 14,15 untersuchen haben.
Mikroinjizieren rAAV-Cre in diskrete Hirnregionen floxed Mäusen und dann testen sie in der CPP Paradigma ermöglicht Untersuchung der spezifischen Gene, die die verschiedenen Phasen der süchtig-ähnliches Verhalten und wo sie tätig sind, zu vermitteln. Verwenden Sie dieses Paradigmas ist in unserem Verständnis geholfen, wie wiederholte Kokain Verwaltung im Wesentlichen die br entführtains Lohn-Schaltung verursacht maladaptive Veränderungen in der molekularen Signalwege und Genexpression, dass zu den süchtigen Zustand 1,16,17 führen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Regional-und zeitlich-spezifische Gen-Ablation über stereotaktischen Mikroinjektion von viralen Vektoren mit CPP kombiniert das Aussterben und Wiedereinstellung Phasen beinhaltet ermöglicht die Untersuchung der spezifischen Beiträge von Genen zu drei verschiedene Phasen der Sucht-Verhalten. Während konditionellen Knockout, die erreicht werden, indem die traditionelle Cre-loxP-System sorgt für räumlich-zeitlich beschränkt Genablation, stereotaxically Mikroinjizieren Cre-Rekombinase in diskrete Hirnareale von floxe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Anni Lee und Maureen Byrne für ihre Hilfe danken, die Gründung der erweiterten Klimaanlage Platzpräferenz Protokoll.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
| Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
| rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
| rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |
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