Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Summary

Este artigo descreve como microinject vetores virais em cérebro de camundongos e teste em um paradigma de preferência local condicionado, que inclui uma fase de aquisição, extinção e reintegração.

Abstract

Microinjecting virais (rAAV) vetores recombinantes adenoassociados expressando Cre recombinase em regiões do cérebro do rato distintas seletivamente genes knockout de interesse permite maior controle temporal e regionalmente específica de deleção do gene, em comparação com os métodos existentes. Enquanto a deleção condicional também pode ser conseguida por acoplamento ratinhos que expressa recombinase Cre sob o controle de promotores de genes específicos com ratinhos que transportam um gene floxed, microinjecção estereotáxico permite a determinação das áreas discretas do cérebro em pontos de interesse tempo experimentador-determinados. No contexto de preferência lugar cocaína condicionado, e outros paradigmas comportamentais da cocaína tais como a auto-administração ou sensibilização psicomotora, que pode envolver a retirada de restabelecimento fases, extinção e / ou, esta técnica é particularmente útil para explorar a contribuição única de genes-alvo para estes distintos fases de modelos comportamentais de plasticidade induzida pela cocaína. Especificamente,esta técnica permite a ablação seletiva de genes-alvo durante as fases distintas de um comportamento para testar a sua contribuição para o comportamento ao longo do tempo. Em última instância, esse entendimento permite terapêuticas mais específicas, que são mais capazes de lidar com os fatores de risco mais potentes que se apresentam durante cada fase do comportamento viciante.

Introduction

A cocaína é um psicoestimulante altamente reforço. Após a exposição repetida, várias adaptações celulares e moleculares ocorrem em circuitos cerebrais de recompensa relevante que são acreditados para resultar em compulsivo de drogas comportamento de busca, fazendo com altas taxas de recaída que representam um sério problema clínico ^1. A cocaína exerce esses efeitos comportamentais de longa duração por regulação da expressão gênica. Para estudar as adaptações que surgem do uso crônico da cocaína, os modelos pré-clínicos de roedores têm sido amplamente utilizados. Um tal modelo é a preferência paradigma local condicionado (CPP). Este modelo envolve o desenvolvimento de uma associação entre um ambiente aprendido anteriormente neutro e as propriedades gratificantes de cocaína. Depois de vários pares de cocaína com uma câmara particular, os animais estão autorizados a explorar livremente os ambientes cocaína pareado e não-pareado cocaína e se eles preferem o compartimento de droga pareado, eles dizem ter adquirido uma plac induzida pela cocaínae de preferência. Além disso, na sequência de um período de treino de extinção, este paradigma podem ser usadas para estudar a reintegração específica do contexto do comportamento de procura de cocaína.

Em comparação com outros modelos comportamentais de comportamento aditivo semelhante, tais como a sensibilização psicomotora, que é usada para estudar a longo prazo induzida por cocaína comportamental e plasticidade molecular ^2,3 e auto-administração (SA), que é pensado para mimetizar mais precisamente viciante -como o comportamento encontrado em seres humanos, o paradigma CPP é um procedimento simples para estudar cocaína aprendizagem contextual ^4. Protocolos CPP pode ser convenientemente estendido para incluir as fases reintegração extinção e, à semelhança do SA, que permitem a investigação dos mecanismos subjacentes a ânsia da droga e recaída ^5-7 e que são acreditados para recapitular aspectos do que ocorre em humanos droga comportamento de busca e drogas – e cue-induced recaída ^8-10.

Um mecanismo que está na base dainduzida por cocaína plasticidade comportamental, que é característica de cada uma das fases distintas do CPP, incluindo a aquisição, extinção, e reposição, é a activação de assinaturas únicas de expressão do gene em diferentes regiões do cérebro. Para testar quais genes directamente dentro das regiões do cérebro relevantes para mediar a recompensa cocaína induziu alterações comportamentais, é útil ser capaz de manipular selectivamente de forma regional específica. Uma maneira de conseguir isso é microinject vetores virais recombinantes adenoassociados (rAAV) que expressam Cre recombinase usando cirurgia estereotáxica, em áreas distintas do cérebro de ratos que têm genes alvo ladeado por sites LoxP (ratos floxed). Este método permite um controlo temporal e regionais muito preciso sobre quando e onde os genes são ablação, em ambos os neurónios que dividem e que não se dividem, sem induzir respostas imunes ^11-13. Este nível de controle representa uma vantagem importante sobre a tecnologia tradicional Cre-LoxP de reprodução camundongos floxed with ratinhos que expressam a recombinase Cre sob o controle de um promotor de gene endógeno, em que a temporização e distribuição de deleção do gene pode ser mais fortemente regulado. Além disso, o vetor viral mediada por nocaute gene evita potenciais efeitos de compensação de desenvolvimento que podem ocorrer usando estratégias knockout tradicionais.

Em adição à cocaína CPP, que é aqui descrito, a microinjecção de rAAV-Cre no cérebro de ratinhos floxed para avaliar o papel de genes específicos pode ser aplicado para ubiquamente paradigmas comportamentais que envolvem fases distintas, incluindo a auto-administração e sensibilização psicomotora. Por exemplo, o nosso laboratório tem utilizado a tecnologia de rAAV-Cre para estudar o papel do Ca _{V 1.2} canais de Ca ^{2 +} do tipo-L de cocaína psicomotora sensibilização ^14. Especificamente, rAAV-Cre foi microinjectado no núcleo accumbens (NAC) de ratinhos com o gene que codifica a Ca _v 1.2 floxed, para demonstrar que o Ca _v </sub> 1.2 atuando nesta região medeia a fase de sensibilização psicomotora ^14,15 expressão. No entanto, a estratégia de rAAV-Cre não pode ser utilizado se os ratos com um gene de interesse floxed não existem, como foi a nossa experiência quando se avalia o papel de Ca _V 1.3 canais de Ca ^{2 +} do tipo-L de sensibilização psicomotora. Assim, uma limitação da utilização de rAAV-Cre apresenta-se se os ratos condicionados não existem para um determinado gene de interesse. No entanto, rAAVs que expressam siRNA podem ser usadas para genes alvo knockdown, como fizemos para examinar o papel do CA _V 1.3 canais ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre em regiões cerebrais distintas de camundongos floxed e, em seguida, testá-las no paradigma do CPP permite a investigação sobre os genes específicos que medeiam as várias fases do comportamento viciante-como e onde eles estão atuando. O uso deste paradigma tem ajudado na nossa compreensão de como a administração repetida de cocaína em essência seqüestra o brains circuito de recompensa causando alterações inadequadas em vias de transdução de sinal molecular e expressão de genes que levam ao estado viciado ^1,16,17.

Protocol

Todos os procedimentos são realizados em conformidade com o Weill Cornell Medical College Animal Care Institucional e Comitê de Regras de Uso. 1. Preparação e configuração para entrega estereotáxica de vetores virais Se um instrumento, cotonete estéril, ou a mão usando luva estéril é contaminado ao entrar em contato com uma superfície não-estéril, descarte ou re-esterilizar o instrumento utilizando um esterilizador talão quente, descartar o cotonete ou mudar para no…

Representative Results

CPP Depois de realizar CPP em ratos microinjetados, deve-se verificar que o grupo de controle de injecção (rAAV-GFP) camundongos normalmente adquirido preferência para a câmara de drogas pareado (Figura 1A, 1B). Ratos são considerados como tendo adquirido preferência por uma câmara especial quando preferência cocaína (tempo gasto na câmara de cocaína-emparelhado menos tempo gasto na câmara de solução salina-emparelhado), é significativamente superior em comparaç…

Discussion

Regionalmente e ablação gene específico temporalmente via microinjeção estereotáxica de vetores virais combinados com CPP, que inclui as fases de reintegração extinção e permite uma investigação das contribuições específicas de genes de três fases distintas de comportamento viciante-like. Enquanto knockout condicional que é alcançado utilizando o sistema Cre-LoxP tradicional prevê espaço-temporalmente ablação gene restrito, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase em áreas cerebrais distinta…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004