Stereotaxic Mikroinjeksjon av Viral vektorer som uttrykker Cre rekombinase å studere rollen til målgener i Kokain Kondisjonert Place Preference

Summary

Denne artikkelen beskriver hvordan du microinject virale vektorer i mus hjernen og deretter teste i en betinget sted preferanse paradigme som inkluderer et oppkjøp, utryddelse og gjeninnføringen fase.

Abstract

Microinjecting rekombinant adenoassociated viral (rAAV) vektorer som uttrykker Cre recombinase inn i forskjellige mus hjernen til selektivt knockout gener av interesse muliggjør forbedret timelig-og regionalt spesifikk kontroll av genet sletting, sammenlignet med eksisterende metoder. Mens betinget sletting kan også oppnås ved parring mus som uttrykker Cre recombinase under kontroll av spesifikke gen-arrangører med mus bærer en floxed genet, kan stereotaxic mikroinjeksjon for målretting av diskrete hjernen områder på experimenter-bestemmes tidspunkter av interesse. I sammenheng med kokain condition sted preferanser, og andre kokain atferdsmessige paradigmer som selvadministrering eller psykomotorisk allergi som kan innebære tilbaketrekking, utryddelse og / eller gjeninnsettelse faser, er denne teknikken spesielt nyttig i å utforske den unike bidrag målgener til disse distinkt faser av atferdsmessige modeller av kokain-indusert plastisitet. Konkretdenne teknikken gjør det mulig for selektiv ablasjon av målet gener under diskrete faser av en atferd for å teste deres bidrag til atferd på tvers av tid. Til syvende og sist gjør at denne forståelsen for mer målrettet terapi som er best i stand til å løse de mest potente risikofaktorer som byr seg i hver fase av vanedannende atferd.

Introduction

Kokain er et sterkt forsterkende psykostimulerende. Etter gjentatt eksponering, flere molekylære og cellulære tilpasninger oppstå i belønning-relevant hjernen krets som antas å resultere i compulsive narkotika-søkende atferd, spørre høy forekomst av tilbakefall som utgjør en alvorlig klinisk problem ^en. Kokain utøver disse langvarige atferdsmessige effekter ved regulering av genuttrykk. Å studere tilpasninger som oppstår fra kronisk kokainbruk, har prekliniske gnager modeller blitt brukt mye. En slik modell er den betingede sted preferanse (CPP) paradigme. Denne modellen involverer utvikling av et lært tilknytning mellom et tidligere nøytralt miljø og de givende egenskaper av kokain. Etter flere motstandere av kokain med en bestemt kammer, er dyr lov til å fritt utforske kokain sammenkoblet og ikke-kokain-paret miljøer og hvis de foretrekker narkotika-paret kupé, de er sagt å ha ervervet en kokain-indusert place preferanse. Videre følger en utryddelse treningsperiode, kan dette paradigmet brukes til å studere kontekstspesifikk gjeninnføringen av kokain-søkende atferd.

Sammenlignet med andre atferdsmessige modeller av vanedannende-lignende adferd, slik som psykomotorisk sensibilisering, som brukes til å studere langvarig kokain-indusert og atferdsmessige molekylær plastisitet ^2,3 og selvadministrering (SA), som er antatt å mer nøyaktig etterligne vanedannende -lignende oppførsel funnet hos mennesker, er det CPP paradigmet en enkel prosedyre for å studere kokain kontekstuell læring ^fire. CPP-protokoller kan enkelt utvides til å omfatte utryddelse og gjeninnsettelse faser, i likhet med SA, som gir mulighet for undersøkelse av mekanismene bak narkotika ute og tilbakefall ^5-7 og som antas å rekapitulere aspekter av hva som skjer i menneskets medikamentell-søkende atferd og narkotika – og cue-indusert tilbakefall ^8-10.

En mekanisme som ligger til grunn forkokaininduserte atferdsmessige plastisitet som er karakteristisk for hver av de forskjellige faser av CPP, inkludert ervervet, utryddelse, og gjeninnføringen, er aktivering av unike signaturer av genekspresjon innenfor forskjellige områder av hjernen. Å direkte teste hvilke gener innen lønn-relevante områder av hjernen megle kokain-indusert atferdsendringer, er det nyttig å kunne manipulere dem selektivt i et regionalt-spesifikk måte. En måte å oppnå dette på er å microinject rekombinant adenoassociated viral (rAAV) vektorer som uttrykker Cre recombinase hjelp stereotaxic kirurgi, inn i forskjellige områder av hjernen til mus som har målgener flankert av LoxP nettsteder (floxed mus). Denne fremgangsmåte gir mulighet for svært presis tidsmessig og regional kontroll over når og hvor genene er ablateres, i både delende og ikke-delende neuroner, uten å indusere immunresponser ^11-13. Dette nivået av kontroll er en viktig fordel fremfor tradisjonelle Cre-LoxP teknologi for avl floxed mus wed mus som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av en endogen genpromotoren, ved at tidspunktet for og fordelingen av genet sletting kan mer nøye regulert. I tillegg omgår viral vektor-mediert genet knockout potensielle utviklingsmessige kompenserende effekter som kan oppstå ved hjelp av tradisjonelle knockout strategier.

I tillegg til kokain CPP, som er beskrevet her, mikroinjeksjon av rAAV-Cre inn i hjernen av floxed mus for å vurdere rollen til spesifikke gener man kan bruke overalt til atferdsmessige paradigmer som involverer separate faser, herunder selvadministrering og psykomotorisk sensibilisering. For eksempel har vårt laboratorium utnyttet rAAV-Cre-teknologi for å studere rollen til Ca _v 1.2 L-type Ca ^{2 +} kanaler i kokain psykomotorisk sensibilisering ^14. Nærmere bestemt, ble rAAV-Cre microinjected inn i nucleus accumbens (NAC) av mus med genet som koder for Ca _v 1.2 floxed, for å demonstrere at Ca _v </sub> 1,2 opptrer i denne regionen formidler uttrykk fasen av psykomotorisk sensibilisering ^14,15. Imidlertid kan rAAV-Cre strategien ikke brukes hvis mus med en floxed gen av interesse ikke eksisterer, som var vår erfaring ved vurdering av rollen Ca _v 1.3 L-type Ca ^{2 +} kanaler i psykomotorisk sensibilisering. Derfor presenterer en begrensning for å bruke rAAV-Cre selv om betingede mus ikke eksisterer for et bestemt gen av interesse. Men rAAVs som uttrykker siRNA kan brukes til knockdown mål gener, som vi har gjort for å undersøke hvilken rolle Ca _v 1.3 kanaler ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre i diskrete områder av hjernen floxed mus og så teste dem i CPP paradigmet åpner for gransking av spesifikke gener som formidler de ulike fasene av vanedannende-lignende oppførsel og hvor de opptrer. Bruk av dette paradigmet har hjulpet i vår forståelse av hvordan gjentatt kokain administrasjon i hovedsak kaprer den brains belønning kretser forårsaker mistilpasset endringer i molekylær signaltransduksjonsveiene og genuttrykk som fører til den avhengige tilstand ^1,16,17.

Protocol

Alle prosedyrer er gjennomført i samsvar med Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care og bruk komité regler. En. Klargjøring og oppsett for stereotaxic Levering av virale vektorer Hvis et instrument, steril vattpinne, eller hånd på seg sterile hansken er forurenset ved å komme i kontakt med en ikke-steril overflate, forkaste eller re-sterilisere instrumentet med en varm perle sterilisator, kast bomullspinne eller endre til nye sterile hansker. Plasse…

Representative Results

CPP Etter å ha utført CPP på microinjected mus, bør man kontrollere at kohort av kontroll-injisert (rAAV-GFP) mus har vanligvis fått preferanse for narkotika-paret kammer (Figur 1A, 1B). Mus anses å ha ervervet preferanse for en bestemt kammer når kokain preferanse (tidsbruk i kokain-paret kammer minus tid i saltvann sammenkoblet kammer) er betydelig høyere sammenlignet med baseline preferanse score (Figur 1B, A vs B) . Hvis, som en kohort, trenger kont…

Discussion

Regionalt og timelig-spesifikt gen ablasjon via stereotaxic mikroinjeksjon av virale vektorer kombinert med CPP som inkluderer utryddelse og gjeninnsettelse faser åpner for gransking av de spesifikke bidrag fra gener til tre distinkte faser av vanedannende-lignende oppførsel. Mens betinget knockout som er oppnådd utnytte den tradisjonelle Cre-LoxP gir for spatio-timelig begrenset genet ablasjon, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase i diskrete hjernen områder av floxed mus åpner for enda strammere kontroll…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004