Summary
ライム病は、北米で最も一般的に報告された媒介疾患である。原因物質、 ボレリア·ブルグドルフェリティックマダニによって送信されたスピロヘータ細菌である。動物モデルでの感染の伝播および検出は、我々はここで説明するダニ送り、使用することによって最適化されています。
Abstract
ライム病、 ボレリア·ブルグドルフェリの病原体の伝達は、哺乳動物宿主に目盛りマダニ種の付着および吸血によって起こる。自然界では、この人獣共通細菌性病原体は、リザーバ様々な宿主を使用することができますが、白い足マウス（ シロアシマウス ） は 、北米で幼虫と幼虫ダニの主要な貯水池である。人間は最も頻繁にBに感染した付随的な宿主である幼虫の段階でダニに咬まによるドルフェリ。B.ライム病は風土病サイクルを通じて、そのホストに適応するため、これらのスピロヘータの機能や哺乳類宿主への影響を調査する機能は、ダニの摂食を使用する必要があります。また、（検出および感染性物質の回収のための自然なベクターを用いて）外因診断法の技術が不可解な感染症の研究に有用であった。得るために、幼虫は、その港B.ダニライム病 、ダニは、キャピラリーチューブを通して文化の中で生きスピロヘータを与えている。 2つの動物モデルは、マウスおよびヒト以外の霊長類は、最も一般的にはダニ摂食を伴うライム病の研究のために使用される。我々は、これらのダニが上に供給され、感染または外因診断法のいずれかのために動物から回収することができる方法を実証する。
Introduction
2011年には、ライム病は、北米（第6回最も一般的な全国届出疾患だっhttp://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ）。B.ライム病は、両方の遺伝的および抗原的に（1に概説されている）、汎用性の高い微生物である。その遺伝子構成は、大規模な（> 900 KB）染色体の分離株の間で様々なプラスミド含有量の21プラスミド（12線形、9円形）、までが含まれています。多くは、プラスミドのオープンリーディングフレームの90％がいずれかの既知の細菌配列2,3とは無関係であるように、このスピロヘータについて学んだことです。B.ライム病は、宿主免疫の潜在的な標的として多種多様な抗原を提示する。しかし、未処理の感染がしばしば持続する。ダニの環境と脊椎動物宿主環境とスピロヘータの相互作用は、Bでの適応が必要となる感染過程を通してブルグドル 。いくつかのプラスミドにコードさ遺伝子が示差的温度、pH、細胞密度およびダニのライフサイクル4-8の偶数段の変化に応答して発現することが知られている。
Bの研究自然経路による感染後のライム病の風土病サイクル全体での適応、および宿主応答は、適切な動物モデルでダニを養うための能力に依存しています。このような研究は、Bを抱くティックを生成する技術的な課題に満たされているライム病 、および効率的な伝送および/ またはモデル·ホスト上のダニの供給を確実にする。また、感染したダニの封じ込めや回収が不可欠である。使用されるモデルの中ではライム病研究の貴重なツールとなって、それぞれがマウスとヒト以外の霊長類であり、。 Bの自然保有宿主である白い足マウスと同様に、 ライム病は 、実験用マウスは、Bで持続感染をサポートし、高度に感受性宿主であるブルグドル 9。 FOLこのようなC3H株として疾患感受性マウスの感染をlowing、スピロヘータは、皮膚、膀胱、筋肉、関節や心臓を含む複数の組織に広める。感染に対する炎症反応は、病気にかかった心臓や関節組織につながる。スピロヘータは、このホストに固執し、感染まま、炎症性病変ではなく、ヒトでのプロセスとは異なり、断続的になることがあります。マウスモデルは、このようB.上の多くの情報を提供している関節炎や心炎を含むライム病誘発性の病理学、および免疫応答を10月12日を開催。ダニベクトル13-21からの送信のためのいくつかは、必要に応じて持っている病原体の観点からは、差動で、哺乳動物の感染時に発現特定の遺伝子は、特徴付けられている。
いくつかの動物種は22ライム病を研究するために使用されてきたが、アカゲザルに最も近いヒト疾患23の多臓器文字を模倣する。他とは異なり、動物モデルは、例えば、遊走性紅斑、心炎、関節炎、および末梢および中枢神経系の神経障害などの疾患症状の幅は、マカクで観察される。 B.用マウスにおいて、リザーバホスト初期および後期-広め症状が9珍しくありながらライム病、疾患は、マウス系統、年齢24によって異なります。また、他のげっ歯類、ウサギ、イヌとは、全てのB.神経疾患を示すことができないドルフェリ感染症25。重要なのは、マカクはライムボレリア、すなわち、早期ローカライズされ、早期普及、および後期ライム病26〜28 3段階に特徴的な兆候を示す。遊走性紅斑（EM）は、ヒトの場合29の70〜80％に起こると考えられており、また、アカゲザル28,30に見られる。感染後、スピロヘータは、複数の臓器に接種部位から発信。スピロヘータDNAは、骨格ムーで検出されているscles、心臓、膀胱、末梢神経や神経叢のほか、中枢神経系（大脳、脳幹や小脳、脊髄および硬膜）31。
マウスを食べダニ貯水能力で32〜36を研究し 、Bの研究で、ダニのコロニーの増殖のために、私たちや他の研究チームによって利用されていますドルフェリ病因37〜40。この技術は、マウス41-44に外因診断法およびワクチンの有効性を試験するために使用されている。我々は、供給されたマダニはモデル開発28、ワクチンの有効性45の研究のため、および永続性抗生物質投与後の処置46の評価において外因診断法のためにヒト以外の霊長類にダニがある。その港B.ティックライム病はスピロヘータがライフステージを介して送信されるように、感染したマウスに幼虫を供給し、研究のためのニンフを使って、自然の地方病のサイクルを維持することができる。本報告書で、我々は、野生型または変異型Bで感染ダニを生成する方法について指示するライム病 、毛細管送りを用いて、これはまた、マイクロインジェクション47によって、浸漬48によって達成することができる。 Bの人工導入の目的マダニにブルグドルフェリは 、その透過率は不明である変異株を研究するために、高い感染率とのダニ群を生成するために、すっきりとし、そうでなければ、非感染ダニのコロニーを維持することにより、エラーの可能性を低減することができる。封じ込め及び充満マダニの回収を確実にするように加えて、我々は、マウスおよびヒト以外の霊長類を餌ティックを示す。ダニ供給の使用は、Bに対する免疫応答の将来の研究のために不可欠であるライム病感染、潜在的なライムワクチンの有効性、およびオカルト感染の検出のための外因診断法。
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Protocol
ライム病の研究のための動物の際ダニ接種および給餌の実験的な概要を図1に示されている。
1。 Bと接種幼虫マダニティックキャピラリーチューブの供給を使用して、 ドルフェリ
ダニとの操作を行う際には、弾性スリーブ、手袋、使い捨てフワフワキャップ白い白衣を着用されています。
- 我々の技術は、ブロードウォーターらによって報告されているものの修正版である。49。ピペットプラーを使用して薄さを破るにパスツールピペットを加熱し、引いて毛細管を準備します。鉗子を使用してスコープを解剖して、最適な直径（約0.2mm）にヒントを破る。ダニの口器サイズに標準化管をサイジングガイドとして使用される。ピペットを準備する際にフェイスシールドを着用してください。
- B.を育てるBSK-H培地中で10×2-8間7 / mlの（位相を中間対数）（シグマ）CONにドルフェリ6％ウサギ血清をtaining。
- 4-6週間後、幼虫の脱皮のために23℃で保存されてきた幼虫ティックを使用してください。場所は、皿の外底面に両面テープで小さな60×15ミリメートルペトリ皿の上に刻みます。腹側を上に向けティックを配置します。
- B.内に毛細管先端を浸し混合後のライム病培養管。解剖スコープを使用したダニの口の部分の口円錐の上に毛細管を配置します。 図2Aに示すように、適所に管を固定する成形粘土を使用する。
- 封じ込めの追加のレベルの大規模な透明なプラスチック製の浴槽内に貼付ティックでペトリ皿を置きます。湿った紙タオルに水分を提供するために添加される。排便が明白になるまで、30分〜2時間37℃の熱インキュベーター内でダニを置きます。これはスピロヘータを含むメディアはダニを通過したことを示しています。
- 授乳する前に、ダニの環境への適応を可能にするために23℃で2〜4週間ティックを休ま動物にそれら。
2。 B.をマウスに感染させるダニによるドルフェリ
- 滅菌水にケタミン株式1:10に希釈する。ツベルクリン注射器で腹腔内注射によるケタミン100 mg / kgの各マウスを麻酔
- マウスが完全に麻酔されると、バック（レミントンがスムーズ＆シルキー）電気トリマー罰金を使用して中央に耳からマウスを剃る。
- 他のオブジェクトとの白パンに近く、マウスの毛のない部分に湿らせた絵筆で若ダニ（その港のB.ブルグドル ） を移す。または、感染していないダニは疑わしい感染によるマウスの外因診断法のためにマウスで配置することができます。ダニの配置のためのきれいな、白い表面の使用は、任意の未結合のダニが容易に理解されることを保証するのに役立ちます。
- 専門的な監禁（アレン監禁、ペンシルバニア州アレンタウン）でマウスを置きます。監禁、ケージの底から上昇したステンレス鋼製のグリルで構成されています。 T彼はケージ上部が下にマウスの自由な動きを可能にするのに十分水のボトルホルダーを上昇させるために社内の機械工場によって変更された。パンは、トラップへの水の約2インチのマウス（ 図3A）から落下任意マダニが充填されている。マウスは、麻酔から完全に目覚めるまで低体温症の危険性を最小限に抑えるために、再利用可能なマイクロ波照射加熱パッドは、使用前に、ケージの下に配置されている。彼らは麻酔および食料や水トレー擦れから回復などの動物は、多くの場合、運動失調であるので、これらを削除する必要があります。水位が水没からのマウスの肢を防ぐのに十分に低い。
- 節足動物の取り込みを確実にするために昆布トラップペースト（Contech、ビクトリア、BC州、カナダ）とテープが並んでてきたトレイの中にケージを置きます。マウスを単独でケージに入れ、麻酔の期間中に連続的に観察される。
- マウスは麻酔から完全に目を覚ましている時に2時間以内に、食品トレーや水のボトルケージに置き換えられます。 2の後に4時間後、プラスチック製の小屋とnylaboneからなる筐体濃縮は置き換えられます。
- 3、4、および5日後に、供給されたダニのためのマウス、ケージとケージの水を確認してください。ケージ水はホワイトメタルパン（ すなわち、「金のためにパンを」）を介してふるいにかけている。 FRBはきれいな水ですすいでダニやプラスチックの瓶（ 図3B）で保管してください。 3日目および4に、きれいな水でケージ内の水を交換してください。 5日目に、ケージが、ダニのために徹底的にマウスだけで確認してください。通常、この時点で、すべてのダニが送られてきたマウスは、通常の監禁に戻すことができます。
- オートクレーブ滅菌および処分のためのバイオハザード容器に、液体を含む、マウスのケージからすべての廃棄物を配置します。マウス、常に回復したものに配置されたティック数のログを保管してください。
3。 Bと感染のヒト以外の霊長類でダニを供給ドルフェリまたは外因診断法
- ダニ封じ込め装置を準備します。3インチXの1.75インチ径の円をカット清潔なメスで、測定ガイドを使用して3インチのLeFlap（フラップ）。 BiataneフォームとDuodermに同じ大きさの円をカットするためのテンプレートとして、カットアウトを使用してください。発泡体は、皮膚の表面上にフラップを高め、ダニの可能な破砕を防止するために使用される。 Duodermはクッション性の別の層を追加し、ダニのエスケープから追加されたセキュリティのための封じ込め装置のエッジをオーバーレイします。収容装 置の図を図4に示されている。
- 獣医スタッフは筋肉内注射により5-8 mg / kgのテラゾールで動物を麻酔します。
- サイズ40のブレードを搭載した電気トリマー（オスター）を使用して、動物の毛クリップ。ジャケットでカバーされるすべての領域が切り取られています。バック、フロント、二の腕を。シェービングクリームとデュアルブレードの使い捨てカミソリを使用して、密接×20センチ、横、縦約25cmの面積を剃る。湿ったペーパータオルで拭いてください、皮膚を乾燥させるために弱火で乾燥吹く。
- Tにフラップを配置彼は動物の背部、ちょうど肩甲骨下の背骨の両側に。その場所に円をトレースするためのマーカーを使用しています。 SkinPrepでよく拭き取って円周上の皮膚の領域を準備します。これは、接着剤と封じ込め機器の付着に影響を与える可能性があり、皮膚に油を除去します。円の周りの空間の1cmの周囲に残して〜4cmの幅で皮膚接着剤（SkinBond）の層を適用します。
- Biataneフォームから接着剤バッキングを取り外し、適切なスポットで皮膚に貼り付けます。動物は再び5 mg / kgのテラゾールで獣医スタッフによって麻酔する。皮膚接着剤とHypafixテープで端をシールします。フラップから接着剤バッキングを取り外し、Biataneの上に貼り付けます。 LeFlapのエッジの周りHypafixテープを置き、フラップのメッシュフラップを下にテープで固定し、動物にジャケットを置く。テープと昆布トラップペーストが追加されたセキュリティのための非ヒト霊長類監禁を取り巻く周囲の床に適用されます。
- chemicの影響を最小限に収容装置が適所にある後ダニ摂食ステップ3.4において使用するalsは、目盛は24時間後に添加される。この時点で、デバイスのセキュリティも検査し、必要に応じて補強されている。通常は、20非給餌幼虫（4〜8週間後の幼虫脱皮）がペイントブラシを使用してデバイス内の皮膚に追加されます。
- フラップのメッシュから接着剤バッキングを取り外し、所定の位置に密封する。最後に、接着剤を露出させDuodermバッキングを削除し、封じ込め装置の上に置きます。オープンメッシュサークル全体でHypafixテープの一部を追加し、ジャケットを交換してください。完成した収容装 置は、 図5Aに示されている。
- ジャケットが除去されている上記のように、5日後、動物を麻酔。メッシュ（ 図5B）を介して供給するダニを検査する最初のテープを取り外します。慎重にフラップからDuodermの皮をむく。
- ダニへのアクセスを提供するためにエッジにメッシュ部分を引き戻す。 FRBのダニは頻繁に近くや下にあります泡のサークル（ 図5C）とは、ペイントブラシで除去し、きれいな水に配置されます。 （ 図5D）を1回表示されているすべてのFRBのダニが収集されたデバイスを削除します。
注：多くの場合、収容装置は、単に皮膚から剥離することができる。密着性が強く、潜在的に、皮膚に損傷を与えることができれば、Unisolve溶媒を穏やかな除去のための領域に適用される。肌をイソプロパノールで拭くとダニは23℃で保存する感染のために使用する場合、ダニはBを含まれている番号を確認するために粉砕することができますドルフェリ外因診断法のために使用した場合。、ダニ前腸内容物の分析に1-3週間保持されます。
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Representative Results
これらは、送信のために動物に供給される前に、毛管供給終了後、ダニは通常、2〜3週間、23℃で休息している。毛管給技術を用いて、我々は摂食の90％が港B.ダニことを見出したブルグドル。正ダニの割合は、洗浄することにより決定され、その後マイクロチューブ形乳棒で滅菌PBSでそれらを破砕、過酸化物及びエタノールに刻みます。スライド上に固定し、FITCコンジュゲートされた抗ボレリア種抗体で染色される腸の内容物をPBS中にこぼれた。蛍光顕微鏡で観察した代表的なダニ中腸塗抹標本は、 図2B-Cに示されている
低継代株のB31野生型Bとマウスの感染率ライム病は、ほぼ100％である。 Bの血清学と文化の組み合わせマウス組織からブルグドルフェリは 、各マウスが感染したかどうかを決定するために使用される。ウェスタンブロットshowiB.感染したマウスからngの血清抗体応答ダニによるライム病は、 図3Cに示されている。この技術は、B.の伝達率及び感染性を調べるために使用されているライム病の変異体は、37〜39菌株 。
私たちは、感染および外因診断法のためのヒト以外の霊長類を餌にダニを使用している。努力がフラップ封じ込め装置を実装することによってダニ給紙と完全に供給されたティックの回復を改善するためになされている。フラップ製品は、ヒトでの薬効ウジの適用のために使用されているが、我々は、霊長類を餌ダニのためにそれを修正した。これまでの研究では、ダニの封じ込め27,28,45,46用ハードカプセルを利用し、23.5から52.5パーセントの間の範囲の35.2％の平均供給速度を（＃与えティック/＃がカプセルに追加ティック）、取得した。感染試験において、送信（＃動物が感染/＃に依存供給）率は86.5％を平均した。より最近の実験では、LeFlapを使用して供給速度の間であった 50から90まで%。まれに、従来の方法を使用して、ダニは、カプセルの下で、彼らは乾燥すると死んで粘着テープの中にクロールされています。フラップを使用して改善送り、接着剤の複数の層が含まれているダニを保持している。
ダニ中腸製剤（ 図2B-C）の直接蛍光染色に加えて、より高感度な方法は、B.を検出するために使用することができるダニ内ブルグドル 。分子検出は、およびB.を検出するために使用されていることができる標準または定量PCRとドルフェリ特異的DNA 42,50,51。検出のための一般的なターゲットはぜい肉46,50、OSPC 46とのOspA 42,51遺伝子である。回収されたスピロヘータの生存も中腸製剤の文化によって検査され、ナイーブマウス42にxenodiagnosticティックを供給されています。
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図1。 ボレリアドルフェリの送信のために動物にダニ摂食。摂食に関わる技術の全体的なスキームは、ライム病の研究のために動物に刻みます。ダニは、Bのキャピラリーチューブ給餌の文化ですマウスやヒト以外の霊長類（アカゲザル）のように、ライム病の動物モデルに基づいドルフェリと供給することができます。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2。キャピラリーチューブ供給方法と結果、A）本装置は、右側のダニやキャピラリーチューブの拡大図で、示さにダニを供給するために使用。BC）ダニの中腸からの代表的な画像Bを供給ブルグドル。中腸SMEARSは、抗ボレリア種FITCポリクローナル抗体（カークガード＆ペリーラボ）で染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
図3。実験用マウスを食べマダニのスカプラリスティック 。A）ダニ供給するために使用したマウスに特化監禁。ワイヤー床はダニを集めるための水を鍋の上に上昇している。ダニに感染したマウスからのダニのために使用される貯蔵容器）、麻酔したマウスは、右の画像に表示されています。、B、C）代表イムノブロット。感染後は、Bを含むブロットをプローブするために使用された21日目からの血清ドルフェリ溶解物および組換えOSPCタンパク質、免疫優性抗原。
図4。アカゲザルにダニを供給するために使用ダニの封じ込め装置の概略図。 第一層はBiataneフォームで構成されています。フラップは、泡の上に配置され、Duoderm第3層である。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図5デバイスを介して供給することティック。 マダニのスカプラリスダニ摂食アカゲザルにして、a）完全な封じ込め装置。、B、C）の再生回数は、フラップを除去した後、D）を完全に除去する以下のダニ摂食のサイトデバイス。
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Discussion
その港Bのティック得るために、下流の研究のためのライム病 、ダニ、（1）幼虫期に感染したマウスに与え、（2）Bに浸漬し幼虫や幼虫の段階48のいずれかでのライム病の文化、（3）Bに顕微注入47 ドルフェリ 、または（4）毛細管葉B.ブルグドル49。これらの方法の各々は、ダニの大部分が感染ハーバーB.に使用されることを確実にするためにその目的を有するがライム病は 、我々は、キャピラリー管栄養を好む。スピロヘータの既知量の接種が必要とされない場合、毛管送り方法は、ダニに損傷を与える可能性が少ないを有することができる。それらは、動物に供給される場合、これは重要である。調査官は伝達/感染性変異株をテストしている場合は、この方法も好ましいかもしれない。これは、プラスミド損失52をもたらすことができる培養物中でその成長を認識することが重要であるので、の使用低継代B.ライム病は不可欠です。また、スピロヘータの培地および密度が導入されると、人工なので、ダニは後毛細血管送り、すぐに使用するべきではありません。スピロヘータは、実験に使用する前に、ダニの微小環境に適応するために代わりに、2以上週間の期間が許可される。
マウス上の目盛りを供給するときは、あらかじめマウスを剃る必要はありません。我々は皮膚にダニ唾液の影響を検討しようとした（未発表）これまでの研究では、シェービングが必要であった。そうすることで、カウンタ直感的に、我々は、ダニがいることを発見したと、b）高い供給速度を持っています。A）毛のない皮膚に容易に付着し）とC簡単に見ることができます。供給速度は、幼虫または若虫が使用されるかに応じて異なるが、若虫が使用される場合、一貫して50％以上である。このように、従来の供給にマウスを剃ることは実験のためのだけでなく、植民地の繁殖のためだけではなく、我々の研究室で一般的になってきている。 以前は、チューレーン国立霊長類研究センターの私たちの部門では、34サルは5つの異なる研究で770 マダニ若虫が合意送られてきた。 23.5から52.5パーセントの間の範囲の供給速度（＃送り出さ/＃はカプセルに追加される）の平均35.2％を、ダニ。感染の研究では、伝送平均86.5％の割合。 （未発表の）最近のパイロット研究では、ダニ摂食率が百分の5から75まで変化させ、後続の摂食に対する耐性は明らかではなかった。供給速度が2 回目に比べて3 回目の試みのためにはるかに高かったところが、試みは2と3の間の成功率は、大幅に変化した。ダニもはや "の試み3」チックよりも周囲温度で飼育した「2試み」。ダニ供給に影響を与え、私たちが発見した最も重要な要因は、ダニの年齢と環境の事前実験である。直前に使用するまで4℃の後脱皮に保ったものは、一般的に良く食べます。このように、我々は継続的に格納、ダニを増殖させることをお勧めしますaccordinglYや動物に給餌を行うときに利用可能な目盛りの2の別々の多くを有している。
私達の最も最近の研究では（未発表）当社は、フラップ装置を供給することにハードカプセルを使用したマカクにダニを供給し比較した。十サルLeFlap有するカプセル二回で一回に基づいて供給した。この一連の実験では、観察およびカプセルで17％（レンジ百分の5から25まで）の平均供給速度とフラップと54.75パーセントの平均速度（範囲35から90パーセント）。我々は、ダニ摂食および過酷な接着剤の使用を低減するためのより広い表面積が摂食を改善すると推測する。フラップ封じ込めの使用はまた、研究者は、ダニがデバイス全体を除去せずに取り外すことができるようにダニが、長いフィードまたはそれ以上のダニを追加できるようにどちらかができます。接着剤はいくつかの動物（皮膚の免疫応答に影響を与えたり、誘導可能性がある）に軽度の皮膚刺激を引き起こすかもしれませんが、最後に、フラップ装置自体は、もしあれば、動物のための不快感を制限されている可能性があります。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、技術的なサポートのためにニコールHasenkampfとアマンダタルドのに感謝したいと思います。我々はまた、博士に感謝します。キャピラリー供給方法の指示のためのリンデン胡とアドリアーナマルケスLeFlapの封じ込め装置の推薦のために、博士リセGern。この作品は、NIH / NCRRグラント8 P20 GM103458-09（MEE）によりおよび研究資源のための国民の中心および付与P51OD011104/P51RR000164を通じて国立衛生研究所の研究基盤プログラムの事務所（のoriP）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSK-H | Sigma | B-8291 | |
| Ketamine HCl | |||
| Tangle Trap coating Paste | Ladd research | T-131 | |
| SkinPrep | Allegro Medical Supplies | 177364 | |
| LeFlap, 3" x 3" | Monarch Labs | ||
| Hypafix tape | Allegro Medical Supplies | 191523 | |
| SkinBond | Allegro Medical Supplies | 554536 | |
| UniSolve | Allegro Medical Supplies | 176640 | |
| Biatane Foam, adhesive 4"x4" | Coloplast | 3420 | |
| DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border | Convatec | 187971 | |
| Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom | Lomir Biomedical Inc. | ||
| EQUIPMENT | |||
| Pipet puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Dark field microscope | Leitz Wetzlar | Dialux | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom 2000 | |
| Mouse caging | Allentown caging | ||
References
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