Einrichtung einer<em> In-vitro-</em> System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em> Candida glabrata</em> Menschen THP-1-Makrophagen
Summary
Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren.
Abstract
Eine Zellkultur-Modellsystem, wenn ein enger Mimik von Host-Umweltbedingungen können als preiswerte, reproduzierbare und leicht manipulierbare Alternative zu Tiermodellsysteme für die Untersuchung von einem bestimmten Schritt der mikrobielle Erreger der Infektion dienen. Eine menschliche Monozyten-Zelllinie THP-1, welche bei Phorbolester-Behandlung wird in Makrophagen unterscheiden, wurde bereits früher verwendet, um die Virulenz Strategien vieler intrazelluläre Erreger wie Mycobacterium tuberculosis studieren. Hier ein Protokoll, ein in vitro Zellkulturmodell zu erlassen diskutieren wir System mit THP-1 Makrophagen, um die Wechselwirkung eines opportunistischen Pathogens menschlichen Hefe Candida glabrata mit Host phagozytischen Zellen abzugrenzen. Dieses Modellsystem ist einfach, schnell, offen für Hochdurchsatz-Mutante Bildschirme, und erfordert keine hoch entwickelten Geräten. Eine typische THP-1-Makrophagen-Infektionsversuch dauert ca. 24 Stunden mit einer zusätzlichen Stunde 24-48 wiederhergestellt intrazellulären ermöglichenHefe auf reichen Medium für koloniebildende Einheit-basierte Analyse Rentabilität wachsen. Wie andere in-vitro-Modellsysteme, ist eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes Schwierigkeiten bei Extrapolation der zu einer sehr komplexen Immunzellschaltkreis in den menschlichen Wirt vorhandenen erzielten Ergebnisse. Trotz dieser, ist jedoch die aktuelle Protokoll sehr nützlich, um die Strategien, die eine Pilzerreger verwenden kann, zu umgehen / entgegenzuwirken antimikrobielle Reaktion und zu überleben, anzupassen, und vermehren sich in den nährstoffarmen Umfeld von Wirtsimmunzellen aufzuklären.
Introduction
Candida-Spezies sind die führende Ursache von lebensbedrohlichen invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten ein. Candida glabrata, einer aufstrebenden nosokomiale Erreger, ist die zweite oder dritte am häufigsten isolierten Candida-Spezies aus Intensivstation Patienten, abhängig von der geographischen Lage 3.1. Phylogenetisch, C. glabrata, einem haploiden Hefezellen, enger mit den nicht pathogenen Modell Hefe Saccharomyces cerevisiae als pathogene Candida spp. einschließlich C. 4 albicans. In Übereinstimmung damit, C. glabrata fehlen einige Schlüsselpilz Virulenz inklusive Gegen, sekretierten proteolytischen Aktivität und morphologische Plastizität 4-5.
Obwohl C. glabrata bildet keine Hyphen, es zu überleben und zu replizieren in murinen und humanen Makrophagen 6-8 was darauf hindeutet, dass es einzigartig Pathogenese-Mechanismen entwickelt wurden, können. Nur begrenzte Informationen über die Strategien zur Verfügung, die C. glabrata beschäftigt, um zu überleben nährstoffarmen intrazellulären Makrophagen Umwelt und oxidative und nicht-oxidative entgegenzuwirken Wirtsreaktionen von Immunzellen 5 montiert. Ein entsprechendes Modell Makrophagen-System ist eine Voraussetzung, um die Wechselwirkung von C abgrenzen glabrata mit Wirts Phagozyten über funktionelle Genom-und Proteom-Ansätzen. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) des humanen und murinen Ursprungs sind, sind früher verwendet worden, um die Wechselwirkung von C zu studieren glabrata mit Wirtsimmunzellen 7,9. , Schwierigkeiten bei der Beschaffung von PBMCs und BMDMs, ihre begrenzte Lebensdauer und intrinsische Unterschiede zwischen den verschiedenen Säugetier Spender beschränken jedoch die Verwendung dieser Zellen als vielseitige Modellsysteme.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung eines in vitro-System, das intracellul studierenar Verhalten von C. glabrata Zellen in Makrophagen aus menschlichen Monozyten-Zelllinie THP-1 abgeleitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls war es, eine einfache, kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Zellkultur-Modellsystem, die leicht manipuliert werden kann, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pilz-Pathogen-Interaktion untersuchen zu erlassen.
THP-1-Zellen wurden bereits verwendet, um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze 10-12 entziffern. Monozytären THP-1-Zellen sind leicht zu pflegen und kann unterschieden werden, bei Phorbolester-Behandlung, um Makrophagen, Monozyten-Makrophagen der menschlichen Mimik und Express entsprechenden Makrophagen-Marker 13. Die wichtigsten Vorteile der THP-1-Makrophagen-Modellsystem sind die einfache Bedienbarkeit und das Fehlen von hoch entwickelten Geräten Anforderung.
Die hier vorgestellte Protokoll ist leicht anpassbar, um die Interaktion von anderen menschlichen Pilzerreger mit hos studierenT-Immunzellen. Das derzeitige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Virulenzfaktoren für die Krankheitserreger von Interesse mit hohem Durchsatz nach Mutanten zu identifizieren. Diese Proof-of-concept wurde durch die erfolgreiche Anwendung von THP-1-Kulturmodellsystem, um einen Satz von 56 Genen, die für das Überleben von C. glabrata in humanen Makrophagen 8 erforderlich sind beispielhaft zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von opportunistischen Pilzinfektionen. Makrophagen tragen zur Verteidigung durch die Einnahme und Zerstörung der Pilzerreger Antimykotika. Somit wird Aufklärung von Faktoren, die für das Überleben und / oder Bekämpfung der antimikrobiellen Funktionen erforderlich sind Makrophagen unser Verständnis von Pilz Virulenz Strategien voraus. In diesem Zusammenhang haben wir ein in-vitro-Zellkultur-Modellsystem unter Verwendung von Makrophagen aus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Innovative Junge Biotechnologist Auszeichnung BT/BI/12/040/2005 und BT/PR13289/BRB/10/745/2009 Zuschuss von Department für Biotechnologie, Regierung von Indien und Kernfonds, des Zentrums für DNA-Fingerprinting and Diagnostics unterstützt werden, Hyderabad. MNR und GB sind die Empfänger von Junior und Senior Research Fellowships des Rates für Wissenschaftliche und Industrielle Forschung auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University. SB ist der Empfänger von Junior und Senior Research Fellowship des Department für Biotechnologie auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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