הקמתה של<em> במבחנה</em> מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em> קנדידה glabrata</em> בהמקרופאגים THP-1 אדם
Summary
המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול להקים מערכת מודל תרבית תאים במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן פקולטטיבי תוך תאי אנושי פטריית קנדידה glabrata עם מקרופאגים אדם אשר יהיה כלי שימושי כדי לקדם את הידע של מנגנוני ארסיות פטרייתי שלנו.
Abstract
מערכת מודל תרבית תאים, אם לחקות קרוב של תנאים סביבתיים מארח, יכול לשמש כאלטרנטיבה זולה, לשחזור ובקלות למניפולציה למערכות מודל חיה ללימוד צעד ספציפי של זיהום חיידקים פתוגנים. שורת תאי monocytic אדם THP-1, אשר, על טיפול אסתר phorbol, הוא מובחן למקרופאגים, כבר בעבר נעשתה שימוש כדי ללמוד אסטרטגיות ארסיות רבים פתוגנים תאיים כגון שחפת Mycobacterium. כאן, אנו דנים בפרוטוקול לחוקק במבחנה מודל תרבית תאים מערכת באמצעות THP-1 מקרופאגים להתוות את האינטראקציה של שמרי הפתוגן אנושי אופורטוניסטי קנדידה glabrata עם תאי phagocytic המארח. מערכת מודל זה היא פשוטה, מהיר, נוח למסכי מוטציה תפוקה גבוהה, ואינה דורשת ציוד מתוחכם. ניסוי זיהום מקרופאג טיפוסי THP-1 לוקח כ 24 שעות עם 24-48 שעות נוספות כדי לאפשר תאיים התאושששמרים לגדול על המצע עשיר למושבה להרכיב ניתוח כדאיות מבוסס יחידה. כמו במבחנה מערכות מודל אחרות, מגבלה אפשרית של גישה זו היא קושי בחיוץ התוצאות שהתקבלו למעגלי תא חיסון מורכבים ביותר קיימים במארח האנושי. אולם, למרות זאת, בפרוטוקול הנוכחי הוא מאוד שימושי כדי להבהיר את האסטרטגיות שהפתוגן פטרייתי עשוי להעסיק להתחמק / לנטרל תגובת מיקרוביאלית ולשרוד, להתאים, ולהתרבות בסביבה התזונתית ירודה של תאים חיסוניים מארחים.
Introduction
מיני קנדידה הם הגורם המוביל לזיהומים פטרייתיים פולשניים מסכנות חיים בחולי מדוכאי חיסון 1. קנדידה glabrata, הפתוגן nosocomial מתעוררים, הוא שני או שלישיים מבודד בתדירות הגבוהה ביותר מיני קנדידה מחולי טיפול נמרץ בהתאם למיקום הגיאוגרפי 1-3. פילוגנטית, ג glabrata, שמרי ניצנים הפלואידים, קשור באופן הדוק יותר לSaccharomyces cerevisiae מאשר spp קנדידה פתוגניים אינם שמרי מודל פתוגניים. כולל ג אלביקנס 4. עולה בקנה אחד עם זו, ג glabrata חסר כמה תכונות ארסיות פטרייתי מרכזיות, כולל הזדווגות, פעילות מפרקי חלבונים מופרשת ופלסטיות המורפולוגית 4-5.
למרות שג glabrata אינו טופס העובש, הוא יכול לשרוד ולשכפל במקרופאגים העכבריים והאנושיים 6-8 טוען כי היא פיתחה מנגנוני פתוגנזה ייחודיים. מידע מוגבל זמין על האסטרטגיות שג glabrata מעסיק לשרוד סביבת מקרופאג תאית תזונתית ירודה ולנטרל חמצוני ותגובות מארח nonoxidative רכובים על ידי תאים חיסוניים מארח 5. מערכת מודל מקרופאג רלוונטי היא תנאי הכרחי כדי להתוות את האינטראקציה של ג glabrata עם תאי phagocytic מארח באמצעות גישות הגנומי וproteomic פונקציונליים. תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) ומקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ממקור אנושי ועכברי, בהתאמה, קודם לכן שימשו ללמוד את האינטראקציה של ג glabrata עם תאים חיסוניים מארח 7,9. עם זאת, קושי בהשגת PBMCs וBMDMs, תוחלת שלהם מוגבלת החיים ווריאציה מקומית בין תורמי יונקים שונים להגביל את הניצול של תאים אלה מערכות מודל צדדי כ.
כאן, אנו מתארים שיטה להקמתה של מערכת במבחנה ללמוד intracellular התנהגות של ג תאי glabrata במקרופאגים נגזרו משורת תאי monocytic אדם THP-1. המטרה הכללית של פרוטוקול זה הייתה לחוקק מערכת מודל פשוטה, זולה, מהירה, ושחזור תרבית תאים שניתן להשפיע בקלות ללמוד היבטים שונים של האינטראקציה הפתוגן מארח פטרייתי.
THP-1 תאים ששמשו בעבר לפענח את התגובה החיסונית המארחת נגד מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים, פטריות ו10-12. תאי THP-1 monocytic קלים לשמור ויכולים להיות מובחן, על טיפול אסתר phorbol, למקרופאגים אשר לחקות מקרופאגים נגזרות מונוציטים של אדם ומבטאים את סמני מקרופאג מתאימים 13. היתרונות העיקריים של מערכת מודל מקרופאג THP-1 הם קלות השימוש וחוסר דרישת ציוד מתוחכמת.
הפרוטוקול המובא כאן הוא להתאמה בקלות ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים פטרייתי אדם אחרים עם הוזt תאים חיסוניים. ההליך הנוכחי גם יכול להיות מועסק על מנת לזהות גורמים ארסי לפתוגן של עניין באמצעות מסכי מוטציה תפוקה גבוהה. הוכחה של רעיון זה באה לידי ביטוי על ידי השימוש המוצלח של מערכת מודל התרבות THP-1 לזהות סט של 56 גנים הנדרשים להישרדותו של ג glabrata במקרופאגים אדם 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת חיסון מולדת משחקת תפקיד חשוב בשליטה על זיהומים פטרייתיים אופורטוניסטיים. המקרופאגים תורמים להגנה נגד פטריות על ידי בליעה והרס של הפתוגן פטרייתי. לפיכך, הבהרה של גורמים הנדרשים להישרדות ו / או מנטרל את הפונקציות מיקרוביאלית של מקרופאגים תקדם את ההבנה של אסטרטג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי חדשני הצעיר biotechnologist פרס BT/BI/12/040/2005 ומענק BT/PR13289/BRB/10/745/2009 מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו וקרנות ליבה של המרכז לDNA טביעת אצבעות ואבחון, היידראבאד. MNR וGB הם המקבלים זוטרים ובכירות מלגות מחקר של מועצת המחקר מדעי ותעשייתי למרדף האחר תואר PhD מאוניברסיטת Manipal. SB הוא הנמען של זוטר ובכירה למחקר מלגה מהמחלקה לביוטכנולוגיה לקראת המרדף האחר תואר PhD מאוניברסיטת Manipal.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
