設立<em>インビトロ</em>システムの細胞内挙動を研究するために、<em>カンジダ·グラブラタ</em>人間のTHP-1マクロファージにおける
Summary
現在の記事は、真菌の病原性のメカニズムの知識を進めるために有用なツールとなり、人間のマクロファージとの通性細胞内のヒトの真菌病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を研究するためのin vitroでの細胞培養モデル系を確立するためのプロトコルの概要を説明します。
Abstract
細胞培養モデル系では、ホスト環境条件の近隣模倣場合、微生物病原体感染の特定の段階の研究のための動物モデル系を、安価で再現性があり、容易に操作可能な代替物として機能することができる。 、ホルボールエステル治療の際に、マクロファージに分化されたTHP-1ヒト単球細胞株は、以前に結核菌を含む多くの細胞内病原体の病原性戦略を研究するために使用されている。ここでは、in vitro細胞培養モデルを制定するためのプロトコルを議論ホスト貪食細胞と日和見人間酵母病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を記述するために、THP-1マクロファージを用いたシステム。このモデル系は、簡単、迅速、ハイスループット変異スクリーニングに適しており、まだ高度な機器を必要としない。典型的なTHP-1マクロファージ感染実験を回収し、細胞内を可能にするために、追加の24〜48時間で約24時間を要するコロニー形成単位ベースの実行可能性の分析のための富栄養培地上で増殖する酵母。他のin vitroモデル系と同様に、このアプローチの可能な限界は、ヒト宿主に存在する非常に複雑な免疫細胞回路に得られた結果を外挿することが困難なことである。しかし、これにもかかわらず、現在のプロトコルは、真菌病原体が、抗菌応答に対抗して生き残る/回避適応し、宿主免疫細胞の貧栄養環境下で増殖するように使用することができる戦略を解明することは非常に便利です。
Introduction
カンジダ種は、免疫不全患者の生命を脅かす侵襲性真菌感染症の1の主要な原因である。 カンジダ·グラブラタ 、新興院内病原体は、地理的な位置1-3に応じて、集中治療室の患者からの第二または第三の最も頻繁に孤立したカンジダ種である。系統発生的に、C.グラブラタ 、半数体出芽酵母、より密接に病原性カンジダ属に比べcerevisiaeの非病原性のモデル酵母サッカロミセスに関連しています。Cを含むカンス 4。これと一致して、C.グラブラタ交配 、分泌されたタンパク質分解活性及び形態学的可塑性4-5を含むいくつかの重要な真菌の病原性の特徴を欠いている。
C.もののグラブラタが菌糸を形成しない、それが生き残るためには、6〜8は、それが独特の病因メカニズムを開発したことを示唆しているマウスおよびヒトのマクロファージ内で複製することができます。限られた情報は、C.戦略について提供されていますグラブラタは、栄養の乏しい細胞内マクロファージ環境を生き残るためには、酸化および5宿主免疫細胞によって取り付けられた非酸化宿主応答に対抗するために採用しています。関連マクロファージモデル系は、Cの相互作用を描写する前提条件である機能的ゲノムおよびプロテオミクスのアプローチを介してホスト貪食細胞とグラブラタ 。末梢血単核細胞（PBMC）及びヒトおよびマウス由来の骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は、それぞれ、以前のC.の相互作用を研究するために使用されている宿主免疫細胞7,9とグラブラタ 。しかし、PBMCおよびBMDMsを得ることが困難、その限られた寿命と異なる哺乳動物ドナー間本質的な変化は、これらの細胞の活用など多彩なモデルシステムを制限します。
ここでは、intracellulを研究するためのin vitro系の確立のための方法を説明しますCの ARの挙動ヒト単球細胞株THP-1由来マクロファージにおける細胞グラブラタ 。このプロトコルの全体的な目標は、簡単にホスト真菌病原体の相互作用の様々な側面を研究するために操作することができる、簡単で、安価、迅速、かつ再現性の細胞培養モデル系を制定することでした。
THP-1細胞は、以前は、細菌、ウイルス、および真菌10-12を含む広範囲の病原体に対する宿主免疫応答を解読するために使用されている。単球THP-1細胞を維持するのに容易であり、ヒトの単球由来のマクロファージを模倣し、適切なマクロファージマーカー13を発現するマクロファージ、ホルボールエステル治療の際に、区別することができる。 THP-1マクロファージモデル系の主な利点は、使いやすさと洗練された機器の必要がないことである。
ここで紹介するプロトコルは、HOSで、他の人間の真菌病原体の相互作用を研究する容易に適応される免疫細胞をトン。現在の手順はまた、ハイスループット変異スクリーニングを使用して、関心対象の病原体の病原性因子を同定するために用いることができる。この概念実証は、ヒトマクロファージ8にC.グラブラタの生存のために必要とされる56遺伝子のセットを同定するために、THP-1培養モデルシステムの使用の成功により例示した。
Protocol
Representative Results
Discussion
自然免疫系は、日和見真菌感染症の制御に重要な役割を果たしている。マクロファージは、摂取および真菌病原体の破壊によって防衛を抗真菌に貢献。このように、生存および/またはマクロファージの抗菌機能に対抗するために必要な要因の解明は、真菌の病原性戦略の我々の理解を進める。この文脈において、我々は、ヒトの日和見真菌病原C.の相互作用を特徴づけるために、ヒト?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DNAフィンガープリントおよび診断のためのバイオテクノロジー本部、インド政府とセンターのコア·ファンドからの革新的な若手生物工学研究者賞BT/BI/12/040/2005とBT/PR13289/BRB/10/745/2009助成金によって支えられて、ハイデラバード。 MNR GBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けた科学産業研究評議会のジュニアとシニアリサーチフェローの受信者です。 SBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けたバイオテクノロジー本部のジュニアとシニアリサーチフェローシップ受賞。
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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