गंभीर रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद आतंच और वृद्धि कारक कॉकटेल के साथ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व और भेदभाव की पदोन्नति
Summary
वृद्धि कारक युक्त आतंच matrices पूरा रीढ़ की हड्डी transection की साइटों में grafted तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया. Grafted कोशिकाओं को पूरी तरह से घाव गुहा भरा और लंबी दूरी पर मेजबान रीढ़ की हड्डी में axons बढ़ाया कि न्यूरॉन्स सहित कई तंत्रिका कोशिका प्रकार, में भेदभाव.
Abstract
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) स्वयं को नवीनीकृत और न्यूरॉन्स और glia में अंतर कर सकते हैं. प्रतिरोपित एनएससी रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के बाद खो न्यूरॉन्स और glia जगह ले सकता है, और एक घाव ऊपर और नीचे रीढ़ की हड्डी खंडों को फिर से कनेक्ट करने के लिए कार्यात्मक रिले फार्म कर सकते हैं. तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं कलम बांधने का काम पिछले अध्ययनों से रीढ़ की हड्डी में घाव गुहा के भीतर अधूरा भ्रष्टाचार के अस्तित्व द्वारा सीमित किया गया है. इसके अलावा, भ्रष्टाचार सेल अस्तित्व, भेदभाव, और प्रक्रिया विस्तार से ट्रैकिंग अनुकूलित नहीं किया गया था. अंत में, पिछले अध्ययनों में, सुसंस्कृत चूहा एनएससी आम तौर पर भाग्य एक विशेष सेल प्रकार के लिए प्रेरित किया गया था, जब तक बल्कि न्यूरॉन्स से घायल रीढ़ की हड्डी, के लिए grafted जब glia में अंतर करने की सूचना मिली. इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, हम भी गंभीर एससीआई की साइटों के लिए एनएससी के अस्तित्व, एकीकरण और भेदभाव में सुधार के लिए नए तरीकों को विकसित किया है. एनएससी हौसले से हरी FL व्यक्त एक स्थिर ट्रांसजेनिक फिशर 344 चूहा रेखा से भ्रूण दिन 14 रीढ़ की हड्डी (E14) से अलग थेuorescent प्रोटीन (GFP) और वृद्धि कारकों से युक्त एक आतंच मैट्रिक्स में एम्बेडेड थे; घाव गुहा में grafted कोशिकाओं को बनाए रखने और सेल अस्तित्व का समर्थन करने के उद्देश्य से इस सूत्रीकरण. आतंच / वृद्धि कारक कॉकटेल में एनएससी, जिससे सूजन की पीक समय से परहेज है, दो सप्ताह वक्ष स्तर 3 (टी 3) पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेनों के बाद प्रत्यारोपित किया गया. परिणामस्वरूप grafts पूरी तरह से घाव गुहा भरा और मेजबान रीढ़ की उल्लेखनीय लंबी दूरी पर कॉर्ड, और glia में axons बढ़ाया जो दोनों न्यूरॉन्स में विभेदित. GFP व्यक्त सुसंस्कृत मानव एनएससी की Grafts इसी तरह के निष्कर्ष में हुई. इस प्रकार, तरीकों तंत्रिका स्टेम सेल ग्राफ्टिंग, अस्तित्व और vivo में निष्कर्ष के विश्लेषण में सुधार के लिए परिभाषित कर रहे हैं.
Introduction
रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) अक्सर हर्जाना न केवल interneurons और मोटर न्यूरॉन्स की कमानी नुकसान के कारण मस्तिष्क के लिए और से ले जाने के संकेत है कि सफेद बात इलाकों, बल्कि केंद्रीय ग्रे बात है,. एससीआई का परिणाम मोटर और घाव नीचे संवेदी समारोह दोनों का नुकसान हुआ है. दुर्भाग्य से, वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) अनायास स्थायी कार्यात्मक घाटे 1 में जिसके परिणामस्वरूप, पुनर्जन्म नहीं होता है. इसलिए, घायल वयस्क रीढ़ की हड्डी और सुधार मोटर में, संवेदी और स्वायत्त समारोह का पुनर्निर्माण एससीआई अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है. तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), सीधे भ्रूण या वयस्क सीएनएस से अलग है, चाहे खो न्यूरॉन्स और glia बदलने के लिए मजबूर उम्मीदवार कोशिकाओं रहे हैं. इसके अलावा, इन कोशिकाओं को एक घाव साइट 2,3 भर axonal चालन को बहाल करने के लिए नए कार्यात्मक रिले फार्म की क्षमता है.
तिथि करने के लिए, शरीर रचना का एक विस्तृत व्याख्या, electrophys नहीं किया गया हैiological और गंभीर एससीआई के बाद प्रतिरोपित एनएससी द्वारा neuronal रिले गठन के व्यवहार प्रभाव. पहला, प्रतिरोपित एनएससी या भ्रूण सीएनएस ऊतक बड़े घाव cavities में grafted जब खराब जीवित रहते हैं: इस के लिए कई कारण हैं. पिछले अध्ययनों बड़े खाली पित्ताशय घाव cavities 4,5 छोड़ने, पर्याप्त जल्दी सेल नुकसान दिखा. कुछ अध्ययनों में grafted कोशिकाओं बाद में विभाजित है और घाव गुहा 4,5 भरने, लेकिन इस सप्ताह के दिनों की देरी के बाद हो सकता है, और बाद में घाव साइट भरने पूर्ण या संगत नहीं हो सकता होगा. दूसरा, सेलुलर अस्तित्व, भेदभाव / परिपक्वता, और प्रतिरोपित एनएससी के परिणाम पर ध्वनि डेटा प्रदान करता है कि एक कुशल ट्रैकिंग प्रणाली की कमी थी. सबसे पहले पढ़ाई सामान्य गति की दिशा में जैसा कि रक्त प्रवाह में था तथा कुंचन में और प्रत्यारोपण 2,3 से axonal अनुमानों का पता लगाने के लिए प्रतिगामी लेबलिंग का उपयोग किया. हालांकि, इन तकनीकों केवल आंशिक रूप से और अक्सर unclearly लेबल axonal grafted कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले अनुमानों, और दरियाफ्त तरीकों subjec हैंप्रत्यारोपित कोशिकाओं से परे डाई रिसाव की वजह से कलाकृतियों को टी. अन्य समूहों घायल कृंतक रीढ़ की हड्डी 5,6 में मानव भ्रूण एनएससी के प्रत्यारोपण के बाद axonal अनुमानों लेबल करने के लिए मानव विशिष्ट neuronal मार्कर का इस्तेमाल किया. हालांकि, उन अध्ययनों में, xenografts लगातार अच्छी तरह से जीवित नहीं था. हाल ही में, GFP रिपोर्टर जीन के वायरल वितरण सुसंस्कृत एनएससी 7,8 लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, GFP अभिव्यक्ति अक्सर असंगत था और 7 नीचे विनियमित किया जा सकता है. हाल ही में, stably रिपोर्टर जीन, GFP, या मानव अपरा alkaline फॉस्फेट व्यक्त ट्रांसजेनिक दाता चूहों या चूहों के उपयोग में नाटकीय रूप से इन विवो 9,11 में प्रतिरोपित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं / progenitors की ट्रैकिंग में सुधार हुआ है. तीसरा, कई अध्ययनों बरकरार या घायल वयस्क रीढ़ की हड्डी में भ्रष्टाचार के परिवेश में प्रत्यारोपित जब भ्रूण या वयस्क या तो सीएनएस से निकाली गई इन विट्रो सुसंस्कृत चूहा एनएससी विशेष रूप से glial प्रजातियों में अंतर संकेत मिलता है किइन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं स्थानीय वातावरण स्टेम कोशिकाओं के भाग्य का हुक्म हो सकता है यह दर्शाता है कि न्यूरॉन्स और इन विट्रो में glia दोनों में फर्क करने में सक्षम हैं कि इस तथ्य के बावजूद डी 7,12,13,. वैकल्पिक रूप से, सुसंस्कृत एनएससी, वयस्क सीएनएस से ली गई है, खासकर उन विवो 13 में glial प्रजातियों में अंतर करने के लिए आंतरिक defaulty संपत्ति हो सकती है.
क्योंकि ऊपर चर्चा की सीमाओं के कारण, हमारे समूह ने हाल ही में गंभीर रूप से घायल वयस्क रीढ़ की हड्डी में भ्रूण एनएससी ट्रैकिंग, अस्तित्व, और भेदभाव / परिपक्वता सुधार करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल विकसित की है. संक्षेप में, हम में विवो प्रत्यारोपण 14 के बाद GFP अभिव्यक्ति को बनाए कि एक GFP रिपोर्टर जीन व्यक्त एक स्थिर ट्रांसजेनिक फिशर 344 चूहा inbreed लाइन के साथ शुरू हुआ. अगला, हम भ्रूण दिन से 14 फिशर 344 रीढ़ की हड्डी, न्यूरॉन्स और glia दोनों उत्पन्न करने की क्षमता बरकरार रखती है कि विकास का एक मंच हौसले से अलग एनएससी इस्तेमाल किया. अंत में, हम एम्बेडेडविकास युक्त एक आतंच मैट्रिक्स में हौसले से अलग एनएससी कोशिकाओं को बनाए रखने और समान रूप से भ्रष्टाचार सेल अस्तित्व, भेदभाव और एकीकरण का समर्थन करने के लिए लक्ष्य एक बड़े घाव गुहा के भीतर उन्हें वितरित करने के लिए 15-17 कारकों. Grafts T3 पूरा transection, रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद दो सप्ताह के स्थलों में रखा गया था. ये grafted कोशिकाओं को लगातार पूरा transection साइटों भरा और लंबी दूरी की 18 से अधिक मेजबान रीढ़ की हड्डी में axons की बड़ी संख्या को बढ़ा दिया है कि प्रचुर मात्रा में न्यूरॉन्स में विभेदित. इसी तरह के परिणाम इम्युनो कमी चूहों 18 को सभ्य मानव तंत्रिका स्टेम सेल grafts का उपयोग कर प्राप्त किया गया.
Protocol
Representative Results
Discussion
घायल रीढ़ की हड्डी में एनएससी प्रत्यारोपण के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक घाव केंद्र में गरीब अस्तित्व है. घाव साइट में कोई कमी या cavities संभवतः कम या supraspinal axons और चोट नीचे अलग रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों के बीच का?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चूहा संसाधन और अनुसंधान केंद्र धन्यवाद, मिसौरी विश्वविद्यालय, कोलंबिया, मिसौरी, GFP चूहों प्रदान करने के लिए; मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए Neuralstem इंक. इस काम के दिग्गजों प्रशासन, एनआईएच (NS09881), कनाडा के रीढ़ की हड्डी में अनुसंधान संगठन, क्रेग एच. Neilsen फाउंडेशन, और बर्नार्ड और ऐनी स्पिट्जर चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
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