新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア
Summary
私たちは、新生児の大脳皮質および成体脊髄から実行可能なミクログリアの効率的かつ迅速に分離/培養のための方法を概説します。皮質ミクログリアの解剖とメッキが行われて、その後のミクログリアの収穫で、90分以内に達成することができます〜初期切開後10日。
Abstract
ミクログリアのような、そのようなCNS開発の成熟、多発性硬化症、および脊髄損傷などの生理学的および病理学的プロセスにおいて非常に重要な役割を担っている、中枢神経系（CNS）の常駐マクロファージ様細胞であると。ミクログリアが活性化され、そのようなMSや脳卒中に起因する虚血性脳外傷で見られる軸索損傷などの神経損傷または刺激によって行動に動員することができます。 CNSこれらの免疫担当メンバーは、非病的条件下でのシナプス可塑性における役割を持つと考えられている。我々は、他のCNS細胞型および細胞培養デブリの存在のような交絡因子を最小にしながら生細胞数を最大にすることを目的としている新生児および成体組織から培養ミクログリアのためのプロトコルを採用している。我々は、全体のプロセスが実現可能となり再現大きく、容易に識別可能なCNSコンポーネント（ 例えば皮質脊髄セグメント）を利用する。成体細胞の使用多くの病状は主に出生後の脊髄に影響を与える研究としてsが、新生児の脳のミクログリアの使用に適した代替手段です。これらの培養系はまた、直接ミクログリア活性化を阻害または促進することができる化合物の効果を試験するために有用である。ミクログリアの活性化が成体CNS疾患の結果を形作ることができるので、新生児および成人ミクログリアを培養し検討することが可能なインビトロ系での必要性が存在する。
Introduction
ミクログリアは、最も密接に構造と機能1に周辺マクロファージに類似し、CNSの居住者の免疫細胞である。それは、最近生後ミクログリア細胞は出生後の造血前駆細胞は成人の脳2ミクログリアの源であることを以前の概念をupending、原始骨髄前駆細胞から派生し、胚発生の八日前に生成されていることが実証されている。彼らは、いくつかの神経疾患において重要な役割を果たしているとすぐに炎症誘発性または抗炎症性サイトカイン3を解放することによって感染症やけがに対応することができます。したがって、ミクログリアは、疾患の進行に影響を与えるために操作することができるCNS内のスタンドアロンユニットを包含する。分離するために、堅牢で再現性のある方法と文化新生児または成人のミクログリア細胞の開発は、今後の研究にとって重要である。
ミクログリアは、脳病変の数が重要なプレーヤーであることが知られている。より最近では、リングライトESは海馬1、4の歯状回からミクログリア貪食過剰神経前駆細胞として正常な脳の発達と機能にセルに浮上している。ミクログリアは、そのような5-7 MS、神経因性疼痛、および脊髄損傷などの脊髄に影響するいくつかの神経学的条件をも調節することができる。脊髄ミクログリアは、ローカル環境の違いにおそらく活性化信号8,9に応答して脳ミクログリアと比較して異なって反応する。このようにして培養するインビトロ系で適切を確立し、脊髄ミクログリアを検討することが重要である。新生児ミクログリアは、IFN-γ、またはTNF-10,11さらには、特定の疾患のコンテキストでミクログリアを研究するために、成人の細胞を使用する必要性を強調してin vitro刺激後に成体細胞と比較して炎症性サイトカインの窒素酸化物のかなり多くを生成する。
我々は、CUにラボで採用するプロトコルlture新生児ミクログリアは、細胞培養フラスコ12の表面から小膠細胞を除去する目的で、混合膠細胞培養の揺れ利用する最近の方法の変形例である。我々はまた、最初のイップら 13で記述されたプロトコルに基づいて、成体マウスの脊髄からの培養ミクログリアにメソッドを記述します。この方法は、他の利用可能なプロトコルは14と比較して、文化の大人の細胞に迅速な方法を提供します。得られた製剤は70％であるミクログリア、残りのパーセンテージはアストロサイトから構成されている。私たちの文化の純度が他の公開された方法13に比べて低いが、この培養系は、主に脊髄に影響を与える病気の研究のために、強力なその中でだけでなく、様々な活性化刺激に文化応答にミクログリアを探索するのに便利です炎症反応は、主な機能です。
説明されているすべてのプロトコルはストーニーブルックの大学によって承認されているTY IACUC。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミクログリアは、CNSの正常な機能だけでなく、様々な病態に炎症反応を調節する。ミクログリアによる機能性シナプスリモデリングは、正常な脳ホメオスタシス15の維持に関与している。神経性カスケードの間、彼らは、海馬4、16の歯状回から神経前駆細胞の隙間に参加しています。したがって、ミクログリアは、複数の個別の機能を有する全体の開発と成人の広大な帯状を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らのアドバイスや有益なコメントに対してTsirka研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、JCNにRB、NSF-3MT IGERTとLTにターナー論文のフェローシップ、およびNSF-3MT IGERTに、12PRE12060489を設定するためにR01NS42168によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
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