Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы
Summary
Приведем схему методов для эффективного и быстрого выделения / культуре жизнеспособных микроглии из головного мозга новорожденных и взрослых спинного мозга. Вскрытие и покрытие корковых микроглии может быть достигнуто в течение 90 минут, с последующим микроглии урожая происходят ~ 10 дней после первого вскрытия.
Abstract
Микроглии являются резидентами макрофаг-подобные клетки центральной нервной системы (ЦНС) и, таким образом, имеют критически важную роль в физиологических и патологических процессах, таких как ЦНС созревания в развитии, рассеянный склероз и травмы спинного мозга. Микроглии может быть активирована и работу к действию повреждение нейронов или стимуляции, такие как повреждением аксонов увидеть в MS или ишемический мозговой травмы в результате инсульта. Эти иммунокомпетентных членов ЦНС также думают, играют роль в синаптической пластичности, не связанных с патологическими состояниями. Мы используем протоколы для культивирования микроглии от новорожденных и взрослых тканей, которые направлены максимального количества жизнеспособных клеток при минимальных искажающих факторов, таких, как наличие других типов клетки ЦНС и мусора клеточной культуры. Мы используем большой и легко заметных ЦНС компонентов (например, мозга, сегментов спинного мозга), что делает весь процесс возможно и воспроизводимым. Использование взрослой клеткис является подходящей альтернативой использованию новорожденных микроглии мозга, так как многие патологии изучали главным образом влияют на постнатальный спинного мозга. Эти культуры системы также могут быть использованы для непосредственного тестирования эффекта соединений, которые могут быть либо ингибировать или стимулировать активацию микроглии. После активации микроглии может формировать результаты заболевание у взрослого ЦНС, существует необходимость в пробирке систем, в которых новорожденных и взрослых микроглии можно культивировать и изучены.
Introduction
Микроглии резидентом иммунных клетках ЦНС, наиболее близкие по периферийным макрофагов в структуре и функции 1. Недавно было показано, что клетки микроглии послеродовой вытекают из примитивных предшественников миелоидного и генерируется до восьмой день эмбриогенеза, переворачивая предыдущие понятия, что послеродовая кроветворные предшественники являются источником микроглии в мозге взрослого 2. Они играют ключевую роль в нескольких неврологических заболеваний и может быстро реагировать на инфекцию или травму, выпустив провоспалительных или противовоспалительных цитокинов 3. Таким образом микроглии охватывают автономное устройство в ЦНС, что можно манипулировать, чтобы влиять на прогрессирование заболевания. Разработка надежных и воспроизводимых методов, чтобы изолировать и культуре неонатальных или взрослого клетки микроглии важно будущих исследований.
Микроглии, как известно, критический игроков в ряде патологий мозга. Совсем недавно ролы появляются на клетки в нормальное развитие и функционирование мозга как микроглии фагоцитируют избыток предшественников нервных клеток с зубчатой извилине гиппокампа 1, 4. Микроглии может также модулировать несколько неврологических заболеваний, которые влияют на спинного мозга, таких как MS, невропатическая боль и травмы спинного мозга 5-7. Спинной микроглии шнур реагируют по-разному по сравнению с мозгом микроглии в ответ на активацию сигналов 8, 9, вероятно, связано с различиями в местной окружающей среде. Таким образом, важно создать соответствующий в системе пробирке культуру и изучать спинной микроглии мозга. Новорожденных микроглии производства значительно большего из провоспалительных цитокинов оксида азота по сравнению с клетками взрослого после экстракорпорального стимуляции IFN-γ и TNF-10,11 дальнейшее выделение необходимости использовать взрослые клетки микроглии изучать в контексте тех или иных заболеваний.
Протокол мы используем в лаборатории для Culture новорожденных микроглии является разновидностью современных методов, которые используют встряхивания смешанного глиальных культур, с тем, чтобы удалить микроглии с поверхности колбы культуры клеток 12. Мы также описывают способ для культуры микроглии от взрослой мыши спинного мозга на основе протокола впервые описан Yip и др. 13. Этот метод обеспечивает более быстрый способ, чтобы культура клеток взрослого по сравнению с другими доступными протоколы 14. Полученный препарат на 70% микроглии, а оставшуюся часть состоит из астроцитов. Хотя чистота нашей культуры ниже по сравнению с другими опубликованными методами 13, эта культура система полезна для изучения микроглии в культуре ответ на различные стимулы активирующий а также для изучения заболеваний, которые поражают главным образом в спинном мозге и в котором сильное воспалительная реакция является основной функцией.
Все протоколы, описанные были одобрены Stony Brook UniversiTY IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроглии модулировать нормальное функционирование ЦНС, а также воспалительные реакции к различным патологиям. Функциональные синаптической ремоделирования микроглии был вовлечен в поддержание нормального гомеостаза мозга 15. Во время нейрогенного каскада они участвуют в офо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов Tsirka лабораторию для их советы и полезные замечания. Эта работа была поддержана R01NS42168 устанавливать, 12PRE12060489 в РБ, NSF-3MT IGERT и общение Тернер Диссертация на LT, и NSF-3MT IGERT к JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
