Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia
Summary
Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.
Abstract
Mikroglia gibi, bu MSS gelişiminde olgunlaşma, multipl skleroz ve spinal kord yaralanması gibi fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik önemli rolleri olan, merkezi sinir sistemi (MSS) yerleşik makrofaj benzeri hücreler ve. Mikroglia aktif ve MS veya inme kaynaklanan iskemik beyin travması görüldüğü aksonal hasar nöronal yaralanma veya stimülasyon, harekete için işe edilebilir. MSS Bu bağışıklık üyeleri de patolojik olmayan koşullarda sinaptik plastisite rol olduğu düşünülmektedir. Biz diğer merkezi sinir sistemi hücre tipleri ve hücre kültürü enkaz varlığı olarak karıştırıcı değişkenler, en aza indirirken canlı hücre sayıları en üst düzeye çıkarmak amaçlanmıştır yenidoğan ve yetişkin dokulardan kültür mikrogliya için protokolleri kullanır. Biz tüm süreci uygulanabilir ve tekrarlanabilir hale getirir büyük ve kolayca ayırt MSS bileşenleri (örneğin korteks, spinal kord segmentleri), kullanmaktadır. Yetişkin hücrenin kullanımınıbirçok patolojiler özellikle doğum sonrası omurilik etkiler okudu olarak s, neonatal beyin mikroglia kullanımına uygun bir alternatiftir. Bu kültür sistemleri de doğrudan ya da inhibe etmek veya mikrogliyal aktivasyonun teşvik edebilir bileşiklerin etkisini test etmek için yararlıdır. Mikrogliyal aktivasyonun, yetişkin merkezi sinir sisteminde hastalıkların sonuçları şekil bu yana, neonatal ve yetişkin mikroglia kültürlenir ve incelenmiştir edilebileceği in vitro sistemler için bir ihtiyaç vardır.
Introduction
Mikroglia en yakın yapı ve fonksiyon 1 periferik makrofaj benzeri MSS, yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Son zamanlarda doğum sonrası mikroglial hücreleri ilkel myeloid öncü hücrelerden elde ve doğum sonrası hematopoetik ataları yetişkin beyin 2 mikroglia kaynağı olduğu önceki kavramı upending, embriyogenez sekizinci gün önce oluşturulan olduğu gösterilmiştir. Onlar çeşitli nörolojik hastalıklarda önemli rol oynayan ve hızlı bir şekilde pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler 3 bırakarak enfeksiyon veya yaralanma yanıt verebilir. Böylece mikroglia hastalığın ilerlemesini etkileyecek manipüle edilebilir MSS bağımsız bir birim kapsayacak. Izole etmek için sağlam ve üretken kültür ve yenidoğan veya yetişkin mikroglial hücreleri geliştirme ileri çalışmalar için önemlidir.
Mikroglia beyin patolojilerinin bir dizi kritik oyuncu olduğu bilinmektedir. Daha yakın zamanda, roles hipokampus 1, 4 dentat girus gelen mikroglia fagosite aşırı nöral progenitör hücrelerin normal beyin gelişimi ve işlevi hücreleri için ortaya çıkmaktadır. Mikroglia da MS gibi omurilik etkileyen çeşitli nörolojik koşulları, nöropatik ağrı, ve spinal kord yaralanması 5-7 modüle olabilir. Omurilik mikroglia yerel ortamda farklılıklar nedeniyle muhtemelen aktivasyon sinyalleri 8, 9, yanıt olarak beyin mikrogliya göre farklı şekilde etkiler. Bu nedenle in vitro kültür sisteminde uygun bir tesis ve omurilik mikroglia incelemek için önemlidir. Yenidoğan mikroglia, IFN-γ, TNF-a ya da 10,11 bazı hastalıkların bağlamında mikroglia incelemek için yetişkin hücrelerin kullanımı ihtiyacını daha vurgulayarak. Ile in vitro stimülasyondan sonra yetişkin hücrelere kıyasla, pro-inflamatuar sitokin, nitrik oksit önemli ölçüde daha fazla üretmek
Biz cu laboratuarda istihdam protokolüLTURE yenidoğan mikroglia hücre kültürü şişesi 12 yüzeyinden mikrogliya kaldırmak için bir çaba karışık glial kültürlerin sallayarak kullanmak en yeni tekniklerin bir çeşididir. Ayrıca, ilk Yip ve ark 13 ile tarif edilen bir protokole göre yetişkin fare omurilik kültürüne mikroglia için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, mevcut diğer protokolleri 14 ile karşılaştırıldığında kültür yetişkin hücrelere daha hızlı bir yol sağlar. Sonuçta elde edilen müstahzarlarda% 70 mikroglia olan, geri kalan yüzde astrositler oluşmaktadır. Bizim kültür saflığının başka yayınlanmış yöntemler 13 kıyasla daha düşük olmasına rağmen, bu kültür sisteminde özellikle omuriliği ve hastalıkların çalışması için çeşitli aktive edici uyaran hem de kültür yanıt olarak mikroglial keşfetmek için yararlı olan güçlü bir hangi inflamatuvar yanıt bir ana özelliğidir.
Açıklanan tüm protokoller Stony Brook üniversite tarafından onaylanmıştırty IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia MSS normal işleyişi yanı sıra çeşitli patolojiler için inflamatuar yanıtları modüle. Mikroglia tarafından fonksiyonel sinaptik yeniden normal beyin dengesinin 15 bakım sorumlu tutulmuştur. Nörojenik kaskad sırasında, hipokampus 4, 16 dentat girus gelen nöral progenitör hücrelerin boşluk katılmak. Bu nedenle, mikrogliya birden fazla ayrı işlevlere sahip olan boyunca gelişim ve yetişkinlik büyük tarama alanı kapsayacak yenidoğan ve yetişkin mikroglia, çalışm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onların tavsiye ve yararlı yorumlar için Tsirka laboratuar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma JCN RB, bir NSF-3MT IGERT ve LT için bir Turner Tez dostluk ve NSF-3MT IGERT için, 12PRE12060489 SET R01NS42168 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
