Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos
Summary
Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.
Abstract
La microglía son los residentes células similares a los macrófagos del sistema nervioso central (SNC) y, como tal, tienen un papel de importancia crítica en procesos fisiológicos y patológicos tales como la maduración del SNC en desarrollo, la esclerosis múltiple y lesión de la médula espinal. La microglía se puede activar y reclutó a la acción por una lesión o estimulación neuronal, tales como daño axonal visto en la EM o trauma cerebral isquémica resultante de un accidente cerebrovascular. Estos miembros inmunocompetentes del SNC también se cree que tienen papeles en la plasticidad sináptica en condiciones no patológicas. Empleamos protocolos para la microglía cultivo de los tejidos neonatales y adultos que tienen como objetivo maximizar el número de células viables y reducir al mínimo las variables de confusión, tales como la presencia de otros tipos de células del sistema nervioso central y los restos de cultivo celular. Utilizamos componentes del SNC grandes y fácilmente perceptible (por ejemplo, la corteza, los segmentos de la médula espinal), lo que hace que todo el proceso sea factible y reproducible. El uso de célula adultas es una alternativa adecuada para el uso de la microglía del cerebro neonatal, como muchas patologías estudiadas afectan principalmente a la médula espinal después del parto. Estos sistemas de cultivo también son útiles para probar directamente el efecto de los compuestos que pueden inhibir o promover la activación de la microglia. Puesto que la activación microglial puede dar forma a los resultados de la enfermedad en el SNC adulto, hay una necesidad de sistemas in vitro en el que la microglía neonatal y adulto puede cultivar y estudió.
Introduction
La microglía son las células inmunes residentes del SNC, se asemejan más estrechamente macrófagos periféricos en la estructura y la función 1. Recientemente se ha demostrado que las células microgliales postnatal derivan de progenitores mieloides primitivas y se generan antes de que el octavo día de la embriogénesis, volteando la noción anterior de que los progenitores hematopoyéticos postnatales son la fuente de la microglia en el cerebro adulto 2. Juegan un papel clave en varias enfermedades neurológicas y pueden responder rápidamente a una infección o lesión mediante la liberación de citoquinas pro-inflamatorias o anti-inflamatoria 3. Por lo tanto microglia abarca una unidad independiente en el SNC que pueden ser manipulados para afectar la progresión de la enfermedad. El desarrollo de métodos robustos y reproducibles para aislar y cultivar células microgliales neonatal o adulto es importante para futuros estudios.
La microglía son conocidos por ser jugadores críticos en una serie de patologías cerebrales. Más recientemente, rolES están surgiendo para las células en el desarrollo del cerebro y la función normal como microglia fagocitan el exceso de células progenitoras neurales de la circunvolución dentada del hipocampo 1, 4. Microglía también puede modular varias condiciones neurológicas que afectan la columna vertebral, como la esclerosis múltiple, dolor neuropático, y lesiones de la médula espinal 5-7. Microglía de la médula espinal reaccionan de manera diferente en comparación con el cerebro microglia en respuesta a señales de activación 8, 9, probablemente debido a las diferencias en el medio ambiente local. Por lo tanto, es importante establecer un adecuado sistema in vitro para estudiar la cultura y la microglía la médula espinal. Neonatal microglia producen significativamente más de la óxido nítrico citoquina pro-inflamatoria en comparación con las células adultas después de la estimulación in vitro con IFN-γ o TNF-un 10,11 más destacando la necesidad de utilizar células adultas para estudiar la microglía en el contexto de ciertas enfermedades.
El protocolo que utilizamos en el laboratorio para culture neonatal microglia es una variación de los métodos recientes que utilizan agitación de cultivos gliales mixtos en un esfuerzo para eliminar la microglía de la superficie del frasco de cultivo celular 12. También describimos un método para la cultura de la microglia ratón adulto médula espinal sobre la base de un protocolo descrito por primera vez por Yip, et al 13. Este método proporciona una manera más rápida de las células adultas de cultivo en comparación con otros protocolos disponibles 14. La preparación resultante es 70% microglía; el porcentaje restante se compone de los astrocitos. Aunque la pureza de nuestra cultura es más baja en comparación con otros métodos publicados 13, este sistema de cultivo es útil para explorar la cultura microglial en respuesta a diversos estímulos de activación, así como para el estudio de enfermedades que afectan principalmente a la médula espinal y en el que una fuerte respuesta inflamatoria es una característica principal.
Todos los protocolos descritos han sido aprobados por la Stony Brook University IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microglía modular SNC funcionamiento normal, así como las respuestas inflamatorias a diversas patologías. Funcional remodelación sináptica por la microglía se ha implicado en el mantenimiento de la homeostasis normal del cerebro 15. Durante la cascada neurogénica que participan en el aclaramiento de las células progenitoras neurales de la circunvolución dentada del hipocampo 4, 16. Por lo tanto, es necesario desarrollar un sistema de cultivo en el que para estudiar la microglía neonata…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Tsirka por sus consejos y comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, un IGERT NSF-3MT y una disertación comunión Turner a LT, y NSF-3MT IGERT a JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
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