Dyrkning Mikroglia fra Neonatal og Adult Central Nervous System
Summary
Vi skitserer metoder til effektiv og hurtig isolation / kultur af levedygtige microglia fra det neonatale hjernebarken og voksne rygmarven. Dissektion og plating kortikal microglia kan opnås inden for 90 minutter med efterfølgende microglial høst finder sted ~ 10 dage efter den første dissektion.
Abstract
Mikroglia er de bosiddende makrofag-lignende celler i det centrale nervesystem (CNS), og som sådan kritisk vigtige roller i fysiologiske og patologiske processer, såsom CNS modning i udvikling, multipel sklerose, og rygmarvsskade har. Mikroglia kan aktiveres og rekrutteres til handling ved neuronal skade eller stimulering, såsom axonal skade set i MS eller iskæmisk hjerne traumer forårsaget af slagtilfælde. Disse immunkompetente medlemmer af CNS er også menes at have roller i synaptisk plasticitet under ikke-patologiske tilstande. Vi beskæftiger protokoller for dyrkning microglia fra neonatale og voksne væv, der tager sigte på at maksimere de levedygtige celletal samtidig minimere forstyrrende variabler, såsom tilstedeværelsen af andre CNS-celletyper og cellekultur vragrester. Vi udnytter store og let mærkbar CNS-komponenter (f.eks cortex, rygmarv segmenter), hvilket gør hele processen gennemførlig og reproducerbar. Brugen af voksne celles er en egnet alternativ til anvendelsen af neonatale hjerne mikroglia, da mange sygdomme, hovedsagelig studerede påvirke postnatal rygmarven. Disse dyrkningssystemer er også anvendelige til direkte at teste virkningen af forbindelser, der kan enten hæmmer eller fremmer mikroglial aktivering. Da mikroglial aktivering kan forme resultaterne af sygdom i de voksne CNS, er der behov for in vitro-systemer, i hvilke neonatale og voksne mikroglia kan dyrkes og undersøges.
Introduction
Microglia er de bosiddende immunceller af CNS, mest sammenlignelige perifere makrofager i struktur og funktion 1.. Det er for nylig blevet påvist, at postnatal mikrogliaceller stammer fra primitive myeloide stamceller og genereres før den ottende dag embryogenese upending den tidligere opfattelse, at postnatal hæmatopoietiske progenitorer er kilden til mikroglia i den voksne hjerne 2. De spiller centrale roller i flere neurologiske sygdomme og kan hurtigt reagere på infektion eller skade ved at frigive pro-inflammatoriske eller anti-inflammatoriske cytokiner 3.. Således mikroglia omfatte en selvstændig enhed i CNS, der kan manipuleres til at påvirke sygdomsprogression. Udvikle robuste og reproducerbare metoder til at isolere og kultur neonatale eller voksen microglial celler er vigtig for fremtidige undersøgelser.
Mikroglia er kendt for at være kritiske spillere i en række hjernen patologier. For nylig, roles dukker for cellerne i normal hjernens udvikling og funktion som mikroglia fagocytere overskydende neurale stamceller fra dentatgyrus af hippocampus 1, 4. Mikroglia kan også modulere adskillige neurologiske forhold, der påvirker rygmarven, såsom MS, neuropatisk smerte, og rygmarvsskade 5-7. Rygmarv microglia reagerer forskelligt i forhold til hjernen mikroglia som reaktion på aktiveringssignaler 8, 9, sandsynligvis på grund af forskelle i det lokale miljø. Derfor er det vigtigt at etablere en passende in vitro-system til kultur og studere rygmarven microglia. Neonatale mikroglia producere væsentligt flere af de pro-inflammatoriske cytokin nitrogenoxid sammenlignet med voksne celler efter in vitro-stimulering med IFN-γ eller TNF-a 10,11 yderligere fremhæver behovet for at anvende voksne celler til at studere mikroglia i forbindelse med visse sygdomme.
Protokollen vi anvender i laboratoriet til cuLTURE neonatal mikroglia er en variation af nyere metoder, som udnytter rystning af blandede gliaceller kulturer i et forsøg på at fjerne mikroglia fra overfladen af cellen dyrkningskolbe 12. Vi beskriver også en metode til kulturen mikroglia fra voksne mus rygmarven baseret på en protokol først beskrevet af Yip et al 13.. Denne metode giver en hurtigere måde at kultur voksne celler i forhold til andre tilgængelige protokoller 14. Den resulterende præparat er 70% mikroglia og den resterende procentdel består af astrocytter. Selv renheden af vores kultur er lavere i forhold til andre publicerede metoder 13, dette dyrkningssystem er nyttig for at udforske mikroglial i kultur respons på forskellige aktiverende stimuli samt til undersøgelse af sygdomme, der hovedsageligt rammer rygmarven og i hvilken en stærk inflammatorisk respons er en vigtig funktion.
Alle de beskrevne protokoller er endeligt godkendt af Stony Brook Universiteternety IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia modulere CNS normale funktion samt inflammatoriske responser til forskellige patologier. Funktionel synaptisk remodellering af mikroglia er blevet impliceret i opretholdelse af normal hjerne homeostase 15. Under den neurogene kaskade de deltager i clearance af neurale stamceller fra dentatgyrus af hippocampus 4, 16. Derfor er det nødvendigt at udvikle en kultur, i hvilket at studere neonatal og voksne microglia, som vil dække det store skår af udvikling og voksenalderen, hele som micro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmerne af Tsirka laboratorium for deres råd og nyttige kommentarer. Dette arbejde blev støttet af R01NS42168 til SET, 12PRE12060489 til RB, en NSF-3MT IGERT og Turner afhandling stipendium til LT, og NSF-3MT IGERT til JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
