नवजात और वयस्क केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र से संवर्धन Microglia
Summary
हम नवजात मस्तिष्क प्रांतस्था और वयस्क रीढ़ की हड्डी से व्यवहार्य microglia की कुशल और त्वरित अलगाव / संस्कृति के लिए तरीकों की रूपरेखा. कोर्टिकल microglia के विच्छेदन और चढ़ाना प्रारंभिक विच्छेदन निम्नलिखित जगह ~ 10 दिनों लेने के बाद microglial फसल के साथ 90 मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है.
Abstract
Microglia जैसे, ऐसे सीएनएस विकास में परिपक्वता, एकाधिक काठिन्य, और रीढ़ की हड्डी में चोट के रूप में शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के निवासी मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह कर रहे हैं. Microglia सक्रिय और ऐसे एमएस या स्ट्रोक से उत्पन्न इस्कीमिक मस्तिष्क आघात में देखा axonal नुकसान के रूप में neuronal चोट या उत्तेजना, द्वारा कार्रवाई करने के लिए भर्ती किया जा सकता है. सीएनएस के इन असुरक्षित सदस्यों को भी गैर रोग परिस्थितियों में synaptic plasticity में भूमिकाओं के लिए लगा रहे हैं. हम इस तरह के अन्य सीएनएस प्रकार की कोशिकाओं और सेल संस्कृति मलबे की उपस्थिति के रूप में confounding चर, जबकि कम से कम व्यवहार्य सेल नंबर को अधिकतम करने के उद्देश्य से कर रहे हैं कि नवजात और वयस्क ऊतकों से संवर्धन microglia के लिए प्रोटोकॉल को रोजगार. हम पूरी प्रक्रिया को संभव और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है जो बड़े और आसानी से discernable सीएनएस घटकों (जैसे प्रांतस्था, रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों) का उपयोग. वयस्क कोशिका का उपयोगकई विकृतियों मुख्य रूप से प्रसव के बाद रीढ़ की हड्डी को प्रभावित अध्ययन के रूप में है, नवजात मस्तिष्क microglia के उपयोग के लिए एक उपयुक्त विकल्प है. ये संस्कृति सिस्टम भी सीधे या तो रोकना या microglial सक्रियण को बढ़ावा देने सकता है कि यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए उपयोगी होते हैं. Microglial सक्रियण वयस्क सीएनएस में रोग के परिणामों को आकार कर सकते हैं, नवजात और वयस्क microglia सुसंस्कृत और अध्ययन किया जा सकता है जिसमें इन विट्रो प्रणालियों में जाने की जरूरत है.
Introduction
Microglia सबसे निकट संरचना और समारोह 1 में परिधीय मैक्रोफेज जैसी सीएनएस के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं. यह हाल ही में प्रसव के बाद microglial कोशिकाओं आदिम माइलॉयड progenitors से निकाले जाते हैं और प्रसव के बाद hematopoietic पूर्वज वयस्क मस्तिष्क 2 में microglia के स्रोत रहे हैं कि पिछले धारणा upending, embryogenesis के आठवें दिन पहले उत्पन्न कर रहे हैं कि प्रदर्शन किया गया है. वे कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और जल्दी समर्थक भड़काऊ या विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स 3 रिहा द्वारा संक्रमण या चोट का जवाब कर सकते हैं. इस प्रकार microglia रोग प्रगति को प्रभावित करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है कि सीएनएस में एक स्टैंडअलोन इकाई धरना. अलग करने के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के तरीकों और संस्कृति नवजात या वयस्क microglial कोशिकाओं का विकास भविष्य के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है.
Microglia मस्तिष्क विकृतियों की एक संख्या में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों में माने जाते हैं. हाल ही में, rolतों हिप्पोकैम्पस 1, 4 की दांतेदार गाइरस से microglia phagocytose अतिरिक्त तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज के रूप में सामान्य मस्तिष्क के विकास और समारोह में कोशिकाओं के लिए उभर रहे हैं. Microglia भी ऐसे एमएस के रूप में रीढ़ की हड्डी को प्रभावित करने वाले कई न्यूरोलॉजिकल शर्तों, न्यूरोपैथिक दर्द, और रीढ़ की हड्डी में चोट 5-7 न्यूनाधिक कर सकते हैं. स्पाइनल कॉर्ड microglia स्थानीय वातावरण में मतभेद की वजह से शायद सक्रियण संकेतों 8, 9, के जवाब में मस्तिष्क microglia की तुलना में अलग तरह से प्रतिक्रिया. इस प्रकार संस्कृति के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक उचित स्थापना और रीढ़ की हड्डी microglia के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. नवजात microglia IFN-γ या TNF-एक 10,11 कुछ बीमारियों के संदर्भ में microglia के अध्ययन करने के लिए वयस्क कोशिकाओं का उपयोग करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला आगे. के साथ इन विट्रो उत्तेजना में बाद वयस्क कोशिकाओं की तुलना में समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन नाइट्रिक ऑक्साइड का काफी अधिक उत्पादन
हम घन को प्रयोगशाला में रोजगार प्रोटोकॉलLTURE नवजात microglia सेल संस्कृति फ्लास्क 12 की सतह से microglia को दूर करने के प्रयास में मिश्रित glial संस्कृतियों के झटकों का उपयोग जो हाल के तरीकों का एक संस्करण है. हम भी पहले भौंकना, एट अल 13 द्वारा वर्णित एक प्रोटोकॉल पर आधारित वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से संस्कृति microglia के लिए एक विधि का वर्णन है. यह पद्धति अन्य उपलब्ध प्रोटोकॉल के 14 की तुलना में संस्कृति वयस्क कोशिकाओं को एक तेज रास्ता प्रदान करता है. परिणामस्वरूप तैयारी 70% microglia है, शेष प्रतिशत astrocytes की रचना की है. हमारी संस्कृति की पवित्रता प्रकाशित अन्य तरीकों के 13 की तुलना में कम है, इस संस्कृति प्रणाली मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी को प्रभावित और कहा कि रोगों के अध्ययन के लिए विभिन्न सक्रिय उत्तेजनाओं के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए संस्कृति जवाब में microglial की खोज के लिए उपयोगी है एक मजबूत जिसमें भड़काऊ प्रतिक्रिया एक मुख्य विशेषता है.
वर्णित सभी प्रोटोकॉल पथरीले ब्रुक विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया हैty IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia सीएनएस सामान्य कामकाज के साथ ही विभिन्न विकृतियों को भड़काऊ प्रतिक्रियाओं मिलाना. Microglia द्वारा कार्यात्मक synaptic remodeling के सामान्य मस्तिष्क समस्थिति 15 के रखरखाव में शामिल किया गया है. तंत्रिकाजन्य ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी सलाह और उपयोगी टिप्पणी के लिए Tsirka प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम JCN को आरबी, एक NSF-3MT IGERT और लेफ्टिनेंट को एक टर्नर निबंध फैलोशिप, और NSF-3MT IGERT करने, 12PRE12060489 सेट करने R01NS42168 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
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