Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet
Summary
Vi beskriva metoder för effektiv och snabb isolering / kultur livskraftig mikroglia från neonatal cerebral cortex och vuxna ryggmärgen. Den dissekering och plätering av kortikala mikroglia kan åstadkommas inom 90 minuter, med efterföljande microglial skörden sker ~ 10 dagar efter den första dissektion.
Abstract
Mikroglia är de inhemska makrofager-liknande celler i det centrala nervsystemet (CNS) och, som sådan, har kritiskt viktiga roller i fysiologiska och patologiska processer såsom CNS mognad i utveckling, multipel skleros och ryggmärgsskada. Mikroglia kan aktiveras och rekryteras till handling av neuronal skada eller stimulans, såsom skador på nervfibrer ses i MS eller ischemisk hjärnskada till följd av stroke. Dessa immunkompetenta medlemmar i CNS är också tänkt att ha roller i synaptisk plasticitet under icke-patologiska tillstånd. Vi använder protokoll för odling mikroglia från neonatala och vuxna vävnader som syftar till att maximera de livsdugliga cellantal samtidigt minimera störande variabler, såsom förekomsten av andra CNS celltyper och cellodling skräp. Vi använder stora och lätt urskiljbar CNS komponenter (t.ex. cortex, ryggmärgen segment), vilket gör hela processen genomförbart och reproducerbar. Användningen av vuxen cells är ett lämpligt alternativ till användning av neonatal hjärna mikroglia, eftersom många patologier studerade huvudsakligen påverka den postnatala ryggmärgen. Dessa odlingssystem är även användbara för direkt testa effekten av föreningar som antingen kan hämma eller främja microglial aktivering. Eftersom microglial aktivering kan forma resultaten av sjukdomen i de vuxna CNS, finns det ett behov av in vitro-system i vilka neonatal och vuxen mikroglia kan odlas och studeras.
Introduction
Mikroglia är de inhemska immunceller i CNS, som mest liknar perifera makrofager i struktur och funktion 1. Det har nyligen visats att postnatal mikrogliaceller härrör från primitiva myeloida stamceller och genereras innan den åttonde dagen av fosterutvecklingen, upending den tidigare uppfattningen att postnatal hematopoetiska stamceller är källan mikroglia i den vuxna hjärnan 2. De spelar viktiga roller i flera neurologiska sjukdomar och kan snabbt reagera på infektion eller skada genom att släppa pro-inflammatoriska eller anti-inflammatoriska cytokiner 3. Således mikroglia omfatta en fristående enhet i CNS som kan manipuleras för att påverka sjukdomsförloppet. Utveckla robusta och reproducerbara metoder för att isolera och kultur neonatal eller vuxen mikrogliaceller är viktigt för framtida studier.
Mikroglia är kända för att vara kritiska aktörer i ett antal hjärnans sjukdomar. På senare tid, roles växer fram för cellerna i hjärnans normala utveckling och funktion som mikroglia fagocytera överskott neurala stamceller från gyrus gyrus i hippocampus 1, 4. Mikroglia kan också modulera flera neurologiska tillstånd som påverkar ryggmärgen, såsom MS, neuropatisk smärta och ryggmärgsskador 5-7. Ryggmärgen microgliaen reagerar annorlunda än hjärnan mikroglia som svar på aktiveringssignaler 8, 9, troligen beroende på skillnader i den lokala miljön. Därför är det viktigt att inrätta ett lämpligt in vitro-system till kultur och studera ryggmärg mikroglia. Neonatal microgliaen producerar betydligt mer av pro-inflammatoriska cytokiner kväveoxid jämfört med vuxna celler efter stimulering in vitro med IFN-γ eller TNF-a 10,11 ytterligare belysa behovet av att använda adulta celler för att studera mikroglia i samband med vissa sjukdomar.
Protokollet vi använder i labbet till culture neonatal mikroglia är en variant av de senaste metoder som utnyttjar skakning av blandade gliaceller kulturer i ett försök att avlägsna mikroglia från ytan av cellen odlingskolv 12. Vi beskriver också en metod för att kultur mikroglia från vuxen mus ryggmärg baserad på ett protokoll först beskrevs av Yip et al 13. Denna metod ger ett snabbare sätt att celler kultur vuxna jämfört med andra tillgängliga protokoll 14. Den erhållna beredningen är 70% mikroglia, den återstående procenten består av astrocyter. Även renheten av vår kultur är lägre jämfört med andra publicerade metoder 13, är denna kultur som är användbart för att utforska microglial i kultur svar på olika aktiverande stimuli samt för studier av sjukdomar som främst drabbar ryggmärgen och där en stark inflammatorisk respons är en viktig funktion.
Alla de nämnda protokoll har godkänts av Stony Brook University IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia modulera CNS normala funktion samt inflammatoriska svar på olika patologier. Funktionell synaptic ombyggnad av mikroglia har varit inblandad i underhållet av hjärnans normala homeostas 15. Under neurogen kaskad de deltar i clearance av neurala stamceller från gyrus gyrus i hippocampus 4, 16. Därför är det nödvändigt att utveckla en kultur system där för att studera neonatal och vuxen mikroglia, som kommer att täcka den stora stråk av utveckling och vuxenlivet, under vilken mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Tsirka labbet för deras råd och hjälpsamma kommentarer. Detta arbete stöddes av R01NS42168 till SET, 12PRE12060489 till RB, en NSF-3MT IGERT och Turner Disputation gemenskap till LT, och NSF-3MT IGERT till JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
