Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler

Summary

Redning af rekombinante arenaviruses fra klonede cDNA'er, en tilgang kaldet reverse genetik, giver forskerne at undersøge betydningen af ​​specifikke virale genprodukter, samt bidrag af deres forskellige specifikke domæner og restprodukter til mange forskellige aspekter af biologi arenavirus . Ligeledes omvendt genetik teknikker i FDA-godkendte cellelinier (Vero) for udvikling af vacciner giver nye muligheder til generering af effektive og sikre vacciner til bekæmpelse af humane patogene arenaviruses.

Abstract

Udviklingen og implementeringen af arenavirus omvendt genetik repræsenterer et betydeligt gennembrud i arenavirus banehalvdel ^4. Brugen af ​​cellebaserede arenavirus minigenomplasmiderne systemer sammen med evnen til at generere rekombinante infektiøse arenaviruses med forudbestemte mutationer i deres genomer har lettet undersøgelse af bidraget af virale determinanter til de forskellige trin i arenavirus livscyklus, samt virus-host interaktioner og mekanismer arenavirus patogenese ^{1, 3, 11.} Desuden har udviklingen af trisegmented arenaviruses tilladt brugen af arenavirus genom at udtrykke yderligere fremmede gener af interesse og dermed åbne muligheden for arenavirus-baserede vaccine vektor applikationer ^5. Ligeledes er udviklingen af ​​single-cyklus smitsomme arenaviruses stand til at udtrykke reportergener giver et nyt eksperimentelt værktøj til at forbedre sikkerheden for forskning, som involverer highly patogene humane arenaviruses ^16.. Den generation af rekombinante arenaviruses hjælp plasmid-baserede teknikker til omvendt genetik har hidtil påberåbt brugen af gnaver cellelinjer ^7,19, hvilket skaber nogle barrierer for udviklingen af Food and Drug Administration (FDA)-godkendt vaccine eller vaccine vektorer. For at overvinde denne hindring, vi beskriver her en effektiv generation af rekombinante arenaviruses i FDA-godkendte Vero celler.

Introduction

Arenaviruses er indkapslede vira med bisegmented, negativ-strenget RNA-genom ^3, som hører til Arenaviridae familien. Den arenavirus genomet koder fire proteiner i en ambisense mode fra to separate virale segmenter ^3. Den store (L) segment koder for RNA-afhængige RNA-polymerase (L) og den lille RING (Virkelig interessant nyt gen) finger protein (Z), der tjener som den vigtigste drivkraft for virus spirende. Den lille (S) segment koder for virale nukleoprotein (NP) og overfladen glycoprotein (GP) (Figur 1).

Adskillige medlemmer af Arenaviridae familien er ansvarlige for dødelig hæmoragisk feber (HF) i mennesker ^3. Principielle bekymringer er Lassa virus (LASV), og Junín virus (JUNV), der er kendt for at forårsage høj dødelighed hos indlagte patienter ^{8, 9.} Selv om disse vira er endemiske for Vestafrika og landdistrikter Argentina henholdsvisDer er stigende bekymring for import af LASV og JUNV til ikke-endemiske områder på grund af øget rejse ^10. Derudover, selvom ikke normalt er forbundet med alvorlig sygdom hos mennesker, er prototypisk arenavirus lymfatisk choriomeningitisvirus (LCMV) betragtes som en forsømt patogen som der har været tilfælde af dødelig infektion i immunsvækkede patienter ^{6, 15} og er ansvarlig for medfødte fosterskader og spontane aborter hos gravide kvinder ^{2, 13.} I øjeblikket er der ingen amerikanske FDA-godkendte vacciner mod arenaviruses og behandling er begrænset til nukleosidanalogen ribavirin, som kun er delvist effektiv og ofte forbundet med betydelige bivirkninger.

Indførelsen af plasmid-baserede revers genetik ⁴ og generering af rekombinante arenaviruses ^{7, 19} har gjort store fremskridt inden for arenavirus forskning. I øjeblikket er gnaverceller (såsom BHK-21) anvendes til generelttion af rekombinante arenaviruses grund af artsspecifikke murine RNA polymerase I (pol-I) promotor, der styrer den første transkription af S og L segmenter. Men virus redning i BHK-21-celler er ikke en godkendt metode til generering af rekombinante arenaviruses som potentielle vaccine frø kandidater. Her har vi dokumentere brugen af ​​menneskelige pol-I promoter til effektiv redning af prototypisk gamle verden (OW) LCMV og den nye verden (NW) JUNV Candid # 1 stamme i Vero-celler. Ved hjælp af en lignende metode, men vi genererede rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV), og Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses, der indeholder yderligere to fremmede gener indkodet i to forskellige S RNA segmenter ^5. Dette nye system ikke blot følger en meget reproducerbar og enkel protokol, men umiddelbart kan gennemføres i dannelsen af ​​rekombinante arenaviruses som potentiel vaccine eller vaccine vektor frø.

Protocol

1.. Arenavirus Rescue Transfektion Vores rednings-system var baseret på anvendelsen af ​​både polymerase II protein ekspressionsplasmider der koder for nukleoprotein (NP) og RNA-afhængige RNA-polymerase-(L), de virale trans-virkende faktorer, der er nødvendige for RNA-replikation og genekspression af arenavirus genomet 7, 19, og plasmider stand til at styre intracellulær syntese, via cellulært RNA-polymerase I (pol-I), af S-og L antigenom RNA-art 7. I vores unde…

Representative Results

Vellykket redning af en rekombinant vildtype arenavirus vil blive bekræftet ved tilstedeværelsen af virale antigener ved hjælp af IFA (figur 5). I tilfælde af rekombinante trisegmented vira, kan vellykket viral redning vurderes ved at observere GFP-ekspression ved fluorescensmikroskopi (Figur 6A). Vellykket redning vil blive yderligere bekræftet ved at vurdere Gluc udtryk (figur 6B). Repræsentative resultater illustrerer vellykket redning af vildtype og trisegment…

Discussion

Generering af rekombinante arenaviruses hjælp plasmid-baserede teknikker til omvendt genetik er blevet en udbredt metode til undersøgelse af mange forskellige facetter af arenavirus biologi. Her har vi dokumentere en afgørende forbedring af det nuværende system ved at udføre arenavirus redninger i Vero-celler, der giver mulighed for den potentielle produktion af FDA-godkendte vaccinekandidater mod arenaviruses og vaccine vektorer mod andre smitsomme sygdomme.

De eksperimentelle involver…

Materials

			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.