Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

Summary

Salvataggio di arenavirus ricombinanti da cDNA clonati, un approccio denominato invertire la genetica, permette ai ricercatori di indagare il ruolo di specifici prodotti genici virali, così come il contributo dei loro diversi domini e residui specifici, per diversi aspetti della biologia di arenavirus . Allo stesso modo, invertire tecniche di genetica in linee cellulari approvato dalla FDA (Vero) per lo sviluppo di vaccini fornisce nuove possibilità per la generazione di vaccini efficaci e sicuri per combattere arenavirus patogeni umani.

Abstract

Lo sviluppo e l'attuazione di arenavirus genetica inversa rappresenta un significativo passo avanti nel campo ⁴ arenavirus. L'uso di sistemi minigenome Arenavirus base di cellule insieme con la capacità di generare ricombinanti arenaviruses infettive con mutazioni predeterminate nei loro genomi ha facilitato l'indagine del contributo dei determinanti virali nelle diverse fasi del ciclo di vita arenavirus, così come virus-ospite interazioni e meccanismi di patogenesi arenavirus ^{1, 3, 11.} Inoltre, lo sviluppo di arenaviruses trisegmented ha permesso l'utilizzo del genoma arenavirus di esprimere ulteriori geni estranei di interesse, aprendo così la possibilità di applicazioni vettore di vaccino arenavirus basati ^5. Analogamente, lo sviluppo di ciclo unico arenaviruses infettivi capaci di esprimere geni reporter fornisce un nuovo strumento sperimentale per migliorare la sicurezza di ricerca che coinvolge highly patogeni arenavirus umani ^16. La generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based ha finora invocato l'uso di linee cellulari di roditori ^7,19, il che pone alcune barriere per lo sviluppo di Food and Drug Administration (FDA) con licenza vaccino o di vettori vaccinali. Per superare questo ostacolo, si descrive qui la generazione efficiente di arenavirus ricombinanti in cellule Vero approvato dalla FDA.

Introduction

Arenavirus sono virus con involucro con bisegmented, negativo-stranded RNA del genoma ³ che appartengono alla famiglia Arenaviridae. Il genoma codifica arenavirus quattro proteine ​​in modo ambisense da due segmenti virali separati ^3. Il grande segmento (L) codifica per la RNA polimerasi RNA-dipendente (L) e il piccolo anello (davvero interessante nuovo gene) finger proteina (Z), che serve come il principale motore di virus in erba. Il piccolo (S) segmento codifica la nucleoproteina virale (NP) e la glicoproteina di superficie (GP) (Figura 1).

Diversi membri della famiglia Arenaviridae sono responsabili della febbre emorragica letale (HF) in esseri umani ^3. Di principio preoccupazioni sono virus Lassa (LASV) e virus Junin (JUNV), che sono noti per causare un'elevata mortalità nei pazienti ospedalizzati ^{8, 9.} Anche se questi virus sono endemiche in Africa occidentale e rurale Argentina, rispettivamente,vi sono preoccupazioni crescenti di importazione di LASV e JUNV ad aree non endemiche a causa di un aumento di viaggio ^10. Inoltre, anche se normalmente non associata a malattia grave nell'uomo, il arenavirus prototipo virus coriomeningite linfocitaria (LCMV) è considerato un agente patogeno trascurato in quanto non vi sono stati casi di infezione letale in pazienti immunocompromessi ^{6, 15} ed è responsabile per i difetti congeniti alla nascita e aborti spontanei in donne in gravidanza ^{2, 13.} Attualmente non ci sono US FDA ha approvato i vaccini contro arenavirus e il trattamento è limitato al nucleoside analogo ribavirina, che è solo parzialmente efficace e spesso associata a significativi effetti collaterali.

L'introduzione di inversione plasmide a base genetica ⁴ e la generazione di ricombinanti arenavirus ^{7, 19} hanno notevolmente migliorato il campo di ricerca arenavirus. Attualmente, cellule di roditore (come BHK-21) vengono utilizzati per la generzione di arenaviruses ricombinanti dovute alla specie-specifico murino RNA polimerasi I (pol-I) promotore dirigere la trascrizione iniziale della S e L segmenti. Tuttavia virus salvataggio in cellule BHK-21 non sono un metodo approvato per la generazione di ricombinanti arenavirus come potenziali candidati di semi vaccino. Qui documentiamo l'uso del umano pol-I promoter di soccorso efficiente del prototipo Vecchio Mondo (OW) LCMV e il Nuovo Mondo (NW) JUNV Candid # 1 ceppo di cellule Vero. Utilizzando una metodologia simile, abbiamo generato ricombinante trisegmented LCMV (r3LCMV) e Candid # 1 (r3Candid # 1) arenavirus che contengono due geni estranei aggiuntivi codificati in due diversi segmenti di RNA S ^5. Questo nuovo sistema segue non solo un protocollo altamente riproducibile e semplice ma può essere immediatamente attuata la generazione di arenaviruses ricombinanti come potenziale vaccino o semi vettore vaccino.

Protocol

1. Arenavirus Rescue Transfezione Il nostro sistema di salvataggio si basa sull'utilizzo di due polimerasi II proteiche plasmidi di espressione codificanti la nucleoproteina (NP) e RNA-dipendente-RNA-polimerasi (L), i fattori trans-agenti virali necessarie per la replicazione dell'RNA e l'espressione genica del genoma arenavirus 7, 19, e plasmidi capaci di dirigere la sintesi intracellulare, attraverso l'RNA cellulare polimerasi I (pol-I), del S e L antigenome specie…

Representative Results

Salvataggio di successo di un ricombinante arenavirus wild-type sarà confermata dalla presenza di antigeni virali mediante IFA (Figura 5). Nel caso dei virus ricombinanti trisegmented, salvataggio di successo virale può essere valutata osservando espressione GFP mediante microscopia a fluorescenza (Figura 6A). Salvataggio di successo sarà ulteriormente confermato dalla valutazione dell'espressione Gluc (Figura 6B). Rappresentante risultati illustrano il salvatagg…

Discussion

Generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based è diventata un metodo ampiamente utilizzato per lo studio di molti e diversi aspetti della biologia arenavirus. Qui documentiamo un miglioramento fondamentale per l'attuale sistema eseguendo arenavirus salvataggi su cellule Vero, consentendo la potenziale generazione di candidati vaccini approvati dalla FDA contro arenavirus e vettori di vaccini contro altre malattie infettive.

Le procedure sp…

Materials

			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.