Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

Summary

Rescate de arenavirus recombinantes a partir de ADNc clonado, un enfoque conocido como la genética inversa, permite a los investigadores estudiar la función de los productos específicos de genes virales, así como la contribución de los diferentes dominios y residuos específicos, a diferentes aspectos de la biología de los arenavirus . Del mismo modo, las técnicas de genética inversa en líneas celulares aprobados por la FDA (Vero) para el desarrollo de vacunas ofrece nuevas posibilidades para la generación de vacunas seguras y eficaces para combatir arenavirus patógenos humanos.

Abstract

El desarrollo e implementación de arenavirus genética inversa representa un avance significativo en el campo arenavirus ^4. El uso de los sistemas de minigenoma arenavirus basados ​​en células, junto con la capacidad de generar recombinantes arenavirus infecciosas con mutaciones predeterminadas en sus genomas ha facilitado la investigación de la contribución de los determinantes virales para las diferentes etapas del ciclo de vida arenavirus, así como virus-huésped interacciones y mecanismos de patogénesis arenavirus ^{1, 3, 11.} Además, el desarrollo de arenavirus trisegmented ha permitido el uso del genoma arenavirus para expresar genes extraños de interés adicionales, abriendo así la posibilidad de aplicaciones de vectores de vacunas basados ​​en arenavirus ^5. Del mismo modo, el desarrollo de un solo ciclo de arenavirus infecciosos capaces de expresar genes indicadores proporciona una nueva herramienta experimental para mejorar la seguridad de la investigación con highlŸ arenavirus patógenos humanos ^16. La generación de arenavirus recombinantes utilizando técnicas de genética inversa basadas en plásmidos ha basado hasta ahora en el uso de líneas celulares de roedores ^7,19, lo que plantea algunas de las barreras para el desarrollo de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) con licencia de vacuna o vectores de vacuna. Para superar este obstáculo, como se describe aquí la generación eficiente de los arenavirus recombinantes en células Vero aprobados por la FDA.

Introduction

Los arenavirus son virus envueltos con un bisegmented, genoma de ARN de cadena negativa ³ que pertenecen a la familia Arenaviridae. El genoma arenavirus codifica cuatro proteínas de una manera ambisense a partir de dos segmentos virales separadas ^3. El segmento grande (L) codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN (L) y el anillo pequeño (realmente interesante nuevo gen) de proteínas dedo (Z), que sirve como la principal fuerza impulsora del virus en ciernes. El pequeño segmento (S) codifica la nucleoproteína viral (NP) y la glicoproteína de superficie (GP) (Figura 1).

Varios miembros de la familia Arenaviridae son responsables de la fiebre hemorrágica letal (HF) en los seres humanos ^3. De las preocupaciones principales son el virus de Lassa (LASV) y el virus Junín (JUNV), que se sabe que causa una alta mortalidad en los pacientes hospitalizados, ^{8, 9.} A pesar de estos virus son endémicos de África occidental y rural Argentina, respectivamente,hay cada vez más preocupación de importación de LASV y JUNV a zonas no endémicas debido al aumento de los viajes ^10. Además, a pesar de que normalmente no se asocia con una enfermedad grave en el hombre, el arenavirus prototípico virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) se considera un patógeno descuidado ya que ha habido casos de infección letal en pacientes inmunodeprimidos ^{6, 15} y es responsable de los defectos congénitos y abortos espontáneos en mujeres embarazadas ^{2, 13.} Actualmente no hay EE.UU. FDA aprobó las vacunas contra arenavirus y el tratamiento se limita al análogo de nucleósido ribavirina, que es sólo parcialmente efectiva ya menudo asociado con efectos secundarios significativos.

La introducción de la marcha atrás plásmido basado en la genética ⁴ y la generación de arenavirus recombinantes ^{7, 19} han avanzado en gran medida el campo de la investigación arenavirus. Actualmente, las células de roedores (tales como células BHK-21) se utilizan para la Generación de arenavirus recombinantes debido a la ARN polimerasa I murino específico de la especie (pol-I) promotor que dirige la transcripción inicial de la S y L segmentos. Sin embargo rescate del virus en las células BHK-21 no son un método aprobado para la generación de arenavirus recombinantes como posibles candidatos vacunales de siembra. Aquí se documenta el uso de la pol-I promotor humano de rescate eficiente del Viejo Mundo prototípico (OW) LCMV y el Nuevo Mundo (NW) JUNV Candid # 1 cepa de células Vero. Usando una metodología similar, hemos generado recombinante LCMV trisegmented (r3LCMV) y Candid # 1 (r3Candid # 1) arenavirus que contienen dos genes extraños adicionales codificados en dos segmentos de ARN diferentes S ^5. Este nuevo sistema no sólo sigue un protocolo simple y altamente reproducible, pero se puede implementar inmediatamente en la generación de arenavirus recombinantes como vacuna potencial o semillas de vector de vacuna.

Protocol

1. Arenavirus transfección Rescate Nuestro sistema de rescate se basa en el uso de ambos II plásmidos de expresión de proteínas de polimerasa que codifican la nucleoproteína (NP) y dependiente de ARN-ARN-polimerasa (L), los factores que actúan en trans virales necesarias para la replicación de ARN y la expresión de genes del genoma arenavirus 7, 19, y los plásmidos capaces de dirigir la síntesis intracelular, celular a través de la ARN polimerasa I (pol-I), de la S y L ?…

Representative Results

Rescate exitoso de un arenavirus de tipo salvaje recombinante se confirmó por la presencia de antígenos virales mediante IFA (Figura 5). En el caso de los virus recombinantes trisegmented, rescate viral exitosa puede evaluarse mediante la observación de la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia (Figura 6A). Rescate exitoso será confirmado por la evaluación de la expresión Gluc (Figura 6B). Los resultados representativos que ilustran el rescate co…

Discussion

Generación de arenavirus recombinantes utilizando técnicas de genética inversa basadas en plásmidos ha convertido en un método ampliamente utilizado para la investigación de muchos aspectos diferentes de la biología arenavirus. Aquí se documenta una mejora fundamental en el sistema actual mediante la realización de arenavirus rescata en células Vero, lo que permite la generación potencial de las vacunas aprobadas por la FDA contra el arenavirus y vectores de vacunas contra otras enfermedades infecciosas.

…

Materials

			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.