Transsynaptisk Sporing fra Perifere Mål med pseudorabiesvirus Efterfulgt af kolera toksin og Biotinyleret Dextran Aminer Dobbelt Mærkning
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsynaptisk sporing er blevet et magtfuldt værktøj, der anvendes til at analysere centrale efferents der regulerer perifere mål gennem multi-synaptiske kredsløb. Denne fremgangsmåde har været mest udbredt anvendt i hjernen ved anvendelse af svinepatogen pseudorabiesvirus (PRV) 1. PRV ikke inficerer store aber, herunder mennesker, så det er mest almindeligt anvendt i undersøgelser på små pattedyr, især gnavere. Pseudorabies-stamme PRV152 udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) reportergenet og kun krydser funktionelle synapser retrogradt gennem hierarkisk rækkefølge af synaptiske forbindelser væk fra infektionsstedet 2,3. Andre PRV stammer har distinkte mikrobiologiske egenskaber, og kan transporteres i begge retninger (PRV-Becker og PRV-Kaplan) 4,5. Denne protokol vil udelukkende beskæftige sig med PRV152. Ved at levere viruset ved en perifer sted, såsom muskel, er det muligt at begrænse indtrængen af virus i tHan hjernen gennem et bestemt sæt af neuroner. Den resulterende mønster af eGFP signal i hele hjernen derefter løser de neuroner, der er forbundet med de oprindeligt inficerede celler. Da den distribuerede karakter af transsynaptisk sporing med pseudorabiesvirus gør fortolke specifikke forbindelser inden for en identificeret netværk svært, præsenterer vi en følsom og pålidelig metode beskæftiger biotinylerede dextran aminer (BDA) og kolera toksin subunit b (CTB) til at bekræfte forbindelserne mellem cellerne identificeret ved hjælp af PRV152. Immunokemisk påvisning af BDA og CTB med peroxidase og DAB (3, 3'-diaminobenzidin) blev valgt, fordi de er effektive til at afsløre cellulære processer, herunder distale dendritter 6-11.
Introduction
Transsynaptisk sporing er blevet et magtfuldt værktøj, der anvendes til at analysere centrale efferents der regulerer perifere mål gennem multi-synaptiske kredsløb. Denne fremgangsmåde har været mest udbredt anvendt i gnaverhjerner ved at udnytte det svinepatogen pseudorabiesvirus (PRV), især den svækkede stamme PRV-Bartha først beskrevet i 1961 12. Her præsenteres en protokol til at identificere motoren cortical repræsentation af specifikke muskler eller muskelgrupper anvendelse af et rekombinant pseudorabiesvirus stamme (PRV152), der udtrykker den forbedrede grønt fluorescerende protein (eGFP) reportergenet 2. Den beskrevne fremgangsmåde udnytter adfærd neurotrope vira, som producerer infektiøst afkom, der krydser synapser at inficere andre neuroner inden for en funktionel kredsløb 3,4,13. PRV152, som er isogene med PRV-Bartha, sender kun synapser retrogradt gennem hierarkisk rækkefølge af synaptiske forbindelser væk fra infektionsstedet 3,5 </ sup>. Ved præcist at styre perifere infektionsstedet er det muligt at begrænse indtrængen af virus ind i hjernen gennem en særlig undergruppe af motoriske neuroner. Eftersom virusset inficerer sekventielt kæder af forbundne neuroner, vil det resulterende mønster af eGFP signal i hele hjernen derefter løse netværk af neuroner, der er forbundet med de oprindeligt inficerede celler.
En yderligere fordel ved anvendelse af virus for neural sporing er amplifikation af reporter protein (eGFP i dette tilfælde) i inficerede celler. Dette signal forstærkning giver et niveau af følsomhed, der giver mulighed for påvisning af selv sparsomme fremskrivninger. For eksempel blev en sparsom fremspring fra vibrissa motor cortex til ansigtets motoriske neuroner styrer whiskers findes i rotter under anvendelse af viralt udtrykt grønt fluorescerende protein 14; tidligere undersøgelser har undladt at finde denne fremskrivning hjælp klassiske sporstoffer uden reportergen forstærkning 11,15. desværreMange virale vektorer tracing, som blev brugt i den nævnte undersøgelse, ikke krydser synapser og dermed begrænse deres anvendelse til sporing multi-synaptiske kredsløb.
Mens præsentere tydelige fordele til identificering netværket af celler, der deltager i en motor kredsløb, den distribuerede karakter transsynaptisk sporing med PRV-152 gør fortolkningen specifikke forbindelser i kredsløbet vanskelig. Præsenterer vi derfor en simpel metode til validering specifikke forbindelser inden kredsløb identificeret ved hjælp af PRV-152 ved at dobbeltklikke mærkning ved hjælp biotinylerede dextran aminer (BDA) og kolera toksin subunit b (CTB). Den kombinerede anvendelse af BDA og CTB er en veletableret metode til at spore forbindelser mellem specifikke sæt af neuroner 6-8,11. Når de anvendes sammen, kan disse to sporstoffer visualiseres i samme sektion under anvendelse af en to-farvet DAB (3, 3'-diaminobenzidin) procedure 16. Høj molekylvægt BDA (BDA10kDa) blev udvalgt til denne protokol, fordi det yields detaljeret mærkning af neuronale processer 6,7,9. Yderligere fordele ved BDA10kDa omfatter følgende: Det er fortrinsvis transporteres i anterograd retning 6-8; den kan leveres ved iontoforetisk eller indsprøjtningstryk 6-8; Det kan visualiseres ved et simpelt avidin-biotinyleret HRP (ABC) procedure 17; og det kan afbildes ved hjælp af lys eller elektronmikroskopi 6,7,18. Immunokemisk påvisning af CTB med peroxidase og DAB blev valgt til retrograd mærkning af motorneuroner, fordi det er effektivt til at afsløre cellulære processer, herunder distale dendritter 10,19. Vi har for nylig brugt denne metode til at identificere den vokale motor vej i mus og at afsløre en sparsom forbindelse fra primær motor cortex til larynx motoriske neuroner, som tidligere blev antaget at være fraværende 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er en række spørgsmål, der skal tages i betragtning, når man planlægger et eksperiment ved hjælp PRV152 4,21. Vigtigst er det, pseudorabiesvirus er dødelig. Som tidligere nævnt, store aber, herunder mennesker er ikke modtagelige for smitte, men skal udvises passende omhu for at beskytte andre dyr. Voksne mus typisk overlever fem til syv dage efter podning med den svækkede PRV152 stamme. Derfor PRV152 er ikke egnet til eksperimenter, der kræver overlevelse gange længere end en uge. Desuden infic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Toshio Terashima af Kobe University, Japan, til undervisning larynx kirurgi teknik, og Dr. Lynn Enquist fra Princeton University for at levere PRV-Bartha. Forskningen blev støttet af NIH pioner award DP1 OD000448 til Erich D. Jarvis og en NSF Graduate Research Fellowship pris til Gustavo Arriaga. Tal fra passende krediteret tidligere arbejde anvendes under PLoS ONE åben adgang Creative Commons-licens (CC-BY) i overensstemmelse med tidsskriftets redaktionelle politikker.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
