Transsynaptic Трассировка из периферийных цели с Pseudorabies Касперского Вслед за холерного токсина и Биотинилированный декстран Амины Двухместный маркировки
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Transsynaptic трассировка стать мощным инструментом используются для анализа центральные эфференты, которые регулируют периферийные цели через несколько синаптических схем. Этот подход был наиболее широко применяемым в мозге путем использования свиной патогенных псевдобешенства (PRV) 1. ПРВ не заразить человекообразных обезьян, включая людей, поэтому он наиболее часто используется в исследованиях на мелких млекопитающих, особенно грызунов. Штамм псевдобешенства PRV152 выражает повышенную зеленый флуоресцентный белок (EGFP), репортер ген и только пересекает функциональные синапсы ретроградно через иерархической последовательности синаптических связей вдали от инфекции сайте 2,3. Другие штаммы PRV имеют различные свойства и микробиологические могут перевозиться в обоих направлениях (ПРВ-Беккер и ПРВ-Каплана) 4,5. Этот протокол будет заниматься исключительно PRV152. Предоставляя вирус на периферийном участке, такие как мышцы, можно ограничить проникновение вируса в Тон мозг через определенный набор нейронов. Полученную модель сигнала EGFP по всему мозгу затем разрешает нейроны, которые подключены к первоначально инфицированных клеток. Как распределенный характер transsynaptic трассировки с вирусом ложного бешенства делает интерпретации конкретных соединений в пределах определенного сети трудно, мы представляем чувствительный и надежный метод, использующий биотинилированных декстран амины (BDA) и холерный токсин субъединицы б (CTB) для подтверждения связи между клетками определенных с помощью PRV152. Иммунохимическое обнаружение АРП и CTB с пероксидазой и DAB (3, 3'-диаминобензидина) был выбран потому, что они эффективны при выявлении клеточных процессов, включая дистальных дендритов 6-11.
Introduction
Transsynaptic трассировка стать мощным инструментом используются для анализа центральные эфференты, которые регулируют периферийные цели через несколько синаптических схем. Этот подход был наиболее широко используются в мозге грызунов с использованием вируса свиного патогена псевдобешенства (PRV), особенно ослабленный штамм ПРВ-Барта, впервые описанного в 1961 году 12. Здесь мы приводим протокол для идентификации двигателя корковое представительство конкретных мышц или группы мышц с использованием вирусного рекомбинантные псевдобешенства штамма (PRV152), выражающая усиливается зеленый флуоресцентный белок (EGFP) гена-репортера 2. Описанный метод использует поведение нейротропных вирусов, которые производят потомство, что инфекционный кросс синапсы инфицировать другие нейроны в функциональной схеме 3,4,13. PRV152, что изогенная с ПРВ-Барта, только пересекает синапсов ретроградно через иерархической последовательности синаптических связей от инфекции сайте <3,5/ SUP>. По строго контролировать периферийную сайт инфекции можно ограничить проникновение вируса в мозг через определенное подмножество моторных нейронов. Поскольку вирус инфицирует последовательно соединенных цепей нейронов, в результате структура сигнала EGFP по всему мозгу будет решить сеть нейронов, которые соединены с первоначально инфицированных клеток.
Дополнительным преимуществом использования вируса нейронной трассировки является усиление репортерного белка (EGFP в данном случае) в инфицированных клетках. Это усиление сигнала обеспечивает уровень чувствительности, что позволяет выявлять даже редкие прогнозов. Например, разреженный проекция из вибрисс моторной коре на лицевых мотонейронов, контролирующих усы было обнаружено у крыс с использованием вирусно выраженную зеленый флуоресцентный белок 14; Предыдущие исследования не смогли найти эту проекцию с использованием классических индикаторов без амплификации гена-репортера 11,15. К сожалениюМногие вирусные векторы трассировки, как тот, используемый в указанной работе, не пересекают синапсы, тем самым ограничивая их использование для отслеживания нескольких синаптические цепи.
Представляя различные преимущества для идентификации сети клеток, участвующих в моторном цепи, распределенный характер transsynaptic трассировки ПРВ-152 делает интерпретации конкретных соединений в цепи сложной. Таким образом, мы представляем простой метод для проверки конкретных соединений в пределах, определенных схем с использованием PRV-152 двойной маркировки с помощью биотинилированных декстран амины (BDA) и холерный токсин субъединицы б (CTB). Комбинированное использование BDA и СТВ хорошо создана подход для отслеживания соединений между конкретными множествами нейронов 6-8,11. При использовании вместе, эти два трейсеры могут быть визуализированы в том же разделе, используя два-DAB цвета (3, 3'-диаминобензидина) процедуры 16. Высокая молекулярная масса BDA (BDA10kDa) был выбран для этого протокола, потому что это уields подробную маркировку нейронных процессов 6,7,9. Дополнительные преимущества BDA10kDa включают в себя следующее: это преимущественно транспортируется в направлении антероградной 6-8; он может быть доставлен по ионтофоретическое или инъекции давления 6-8; он может быть визуализированы с помощью простого авидин биотинилированный-HRP (АВС) Процедура 17; и могут быть отображены с помощью световой микроскопии или 6,7,18 электронов. Иммунохимическое обнаружение CTB с пероксидазой и DAB был выбран для ретроградной маркировки мотонейронов, поскольку он эффективен при выявлении клеточных процессов, включая дистальных дендритов 10,19. Мы недавно использовали этот подход для идентификации вокальный двигательный путь у мышей и выявить редкие соединения из первичной моторной коры к гортани двигательных нейронов, которые ранее предполагалось, будет отсутствовать 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть ряд вопросов, которые должны быть приняты во внимание при планировании эксперимента, используя PRV152 4,21. Самое главное, вирус смертелен псевдобешенства. Как упоминалось ранее, приматы, включая человека, не восприимчивы к инфекции, но соответствующий необходимо проявлять осто?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Тосио Terashima Кобе университета, Япония, для обучения технику гортани хирургии, доктор Линн и Энквист из Принстонского университета для подачи PRV-Барта. Исследование было поддержано НИЗ пионером награждения DP1 OD000448 Эриха Д. Джарвис и премии NSF Высшее исследований стипендий в Густаво Арриага. Фигуры из соответствующим зачисленных предыдущей работе используются под PLoS ONE открытого доступа Creative Commons лицензии (CC-BY), в соответствии с редакционной политики журнала.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. . Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
