Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura
Summary
Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.
Abstract
Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV) 1. PRV non infetta grandi scimmie, inclusi gli esseri umani, per cui è più comunemente usato negli studi di piccoli mammiferi, in particolare roditori. Il PRV152 pseudorabbia ceppo esprime la maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter e attraversa solo sinapsi funzionali retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione 2,3. Altri ceppi PRV sono distinte proprietà microbiologiche e possono essere trasportati in entrambe le direzioni (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Questo protocollo si occuperà esclusivamente di PRV152. Fornendo il virus in un sito periferico, come i muscoli, è possibile limitare l'ingresso del virus in tha cervello attraverso un insieme specifico di neuroni. Il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello quindi risolve i neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente. Come la natura distribuita del tracciato transsynaptic con virus pseudorabbia fa interpretare i collegamenti specifici all'interno di una rete identificata difficile, vi presentiamo un metodo sensibile e affidabile utilizzando ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB) per confermare le connessioni tra le cellule identificate utilizzando PRV152. Rilevazione immunochimica di BDA e CTB con perossidasi e DAB (3, 3'-diaminobenzidina) è stato scelto perché sono efficaci a rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali 6-11.
Introduction
Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello dei roditori utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV), in particolare il ceppo attenuato PRV-Bartha descritta per la prima nel 1961 12. Qui, vi presentiamo un protocollo per l'identificazione della rappresentazione corticale motore dei muscoli specifici o gruppi muscolari con un ceppo virale pseudorabbia ricombinanti (PRV152) che esprime la proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter 2. Il metodo descritto sfrutta il comportamento dei virus neurotropi, che producono progenie infettiva che sinapsi trasversali ad infettare altri neuroni all'interno di un circuito funzionale 3,4,13. PRV152, che è isogenic con PRV-Bartha, attraversa solo sinapsi retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione 3,5 </ sup>. Controllando il proprio sito periferico di infezione è possibile limitare l'ingresso del virus nel cervello attraverso uno specifico sottoinsieme di neuroni motori. Come sequenzialmente virus infetta catene di neuroni collegati, il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello si risolverà la rete di neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente.
Un ulteriore vantaggio di utilizzare virus per tracciamento neurale è l'amplificazione della proteina reporter (eGFP in questo caso) all'interno delle cellule infette. Questa amplificazione del segnale fornisce un livello di sensibilità che consente di rilevare anche proiezioni sparse. Ad esempio, una proiezione sparse dalla corteccia motoria vibrissa ai motoneuroni facciali che controllano i baffi è stato trovato in ratti utilizzando viralmente espresso proteina fluorescente verde 14; studi precedenti non sono riusciti a trovare questo proiezione utilizzando traccianti classici senza giornalista amplificazione del gene 11,15. purtroppo, Molti vettori virali tracing, come quello usato nello studio citato, non attraversano sinapsi, limitando così il loro uso per tracciare i circuiti multi-sinaptici.
Pur presentando notevoli vantaggi per identificare la rete di cellule che partecipano a un circuito del motore, la natura distribuita transsynaptic tracciare con PRV-152 rende interpretazione collegamenti specifici all'interno del circuito difficile. Pertanto, vi presentiamo un metodo semplice per la convalida collegamenti specifici all'interno dei circuiti identificate utilizzando PRV-152 per doppia etichettatura con ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB). L'uso combinato di BDA e CTB è un approccio consolidato per tracciare le connessioni tra specifici gruppi di neuroni 6-8,11. Quando usati insieme, queste due rivelatori possono essere visualizzati nella stessa sezione con un DAB due colori (3, 3'-diaminobenzidina) Procedura 16. Alto peso molecolare BDA (BDA10kDa) è stato scelto per questo protocollo perché yields etichettatura dettagliata dei processi neuronali 6,7,9. Ulteriori vantaggi BDA10kDa includono quanto segue: è preferenzialmente trasportato nella direzione anterograda 6-8; può essere trasportato da iontoforetica o pressione di iniezione 6-8; può essere visualizzato da un semplice avidina-HRP biotinilato (ABC) Procedura 17; e può essere ripreso dalla luce o microscopia elettronica 6,7,18. Rilevazione immunochimica di CTB con perossidasi e DAB è stato scelto per l'etichettatura retrograda dei motoneuroni, perché è efficace nel rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali 10,19. Recentemente abbiamo usato questo approccio per identificare il percorso del motore vocale nei topi e per rivelare un collegamento sparse da corteccia motoria primaria per i motoneuroni laringei, che in precedenza era assume siano assenti 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono una serie di questioni che devono essere presi in considerazione al momento di pianificare un esperimento utilizzando PRV152 4,21. Ancora più importante, il virus della pseudorabbia è letale. Come accennato in precedenza, le grandi scimmie, inclusi gli esseri umani non sono suscettibili alle infezioni, ma cure appropriate devono essere esercitati per proteggere gli altri animali. Topi adulti in genere sopravvivono cinque a sette giorni dopo l'inoculazione con il ceppo PRV152 attenuato. Pertanto,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott Toshio Terashima di Università di Kobe, in Giappone, per l'insegnamento della tecnica di chirurgia laringea, e il dottor Lynn Enquist della Princeton University per la fornitura di PRV-Bartha. La ricerca è stata sostenuta da premio pioniere NIH DP1 OD000448 Erich D. Jarvis e un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Le cifre precedente lavoro opportunamente accreditati sono utilizzati sotto la PLoS ONE accesso aperto licenza Creative Commons (CC-BY) in accordo con le politiche editoriali della rivista.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 gauge option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer > 1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/mL & 6 mg/mL |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/mL dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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